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上海优选生物科技有限公司
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β-1,3 葡聚糖酶（β-1,3-glucanase，β-1,3-GA）试剂盒说明书
微量法
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
β-1,3-GA( EC 3.2.1.73)主要存在植物中，催化β-1,3-葡萄糖苷键水解。在植物染病或处于其他逆境条件下，可诱导细胞大量合成β-1,3-GA，因此β-1,3-GA 活性测定广泛应用于植物病理和逆境生理研究。
测定原理：
β-1,3-GA 水解昆布多糖，内切β-1,3-葡萄糖苷键，产生还原末端，通过测定还原糖生成速率来计算其酶活性。
自备仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制：
提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存；
试剂一：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前加入2mL蒸馏水，充分溶解待用；用不完的试剂 4℃保存；
试剂二：液体 30mL×1 瓶，4℃保存；
粗酶液提取：
1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或 200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；12000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL 提取液），进行冰浴匀浆。12000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
测定步骤
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至550nm，蒸馏水调零。
2、样本测定（在1.5mL EP管中依次加入下列试剂）：
试剂名称（μL） |
测定管 |
对照管 |
样本 |
35 |
35 |
蒸馏水 |
35 |
|
试剂一 |
35 |
|
充分混匀，放入 37℃水浴 60 min |
||
试剂二 |
230 |
230 |
充分混匀，95℃水浴 5min（盖紧，防止水分散失），流水冷却，取 200μL 至微量石英比色皿或 96 孔板中， 550nm处记录各管吸光值 A，如果吸光值大于 2，可以用蒸馏水稀释后测定（计算公式乘以相应稀释倍数），ΔA=A 测定-A 对照。每个测定管需设一个对照管。
β-1,3-GA 活性计算：
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准条件下测定回归方程为y=0.0958x-0.0192；x为标准品浓度（mg/mL），y为吸光值。
(1) 按蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白每小时产生1mg还原糖定义为一个酶活性单位。
β-1,3-GA(mg/h/mg prot)=[(ΔA+0.0192)÷0.0958×V1]÷(V1×Cpr)
=10.438×(ΔA +0.0192)÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织每小时产生1mg还原糖定义为一个酶活性单位。
β-1,3-GA(mg/h/g 鲜重)=[( ΔA +0.0192)÷0.0958×V1]÷(W×V1÷V2)
= 10.438×(ΔA +0.0192)÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞每小时产生1mg还原糖定义为一个酶活性单位。
β-1,3-GA(mg/h /104cell)= [( ΔA +0.0192)÷0.0958×V1]÷(500×V1÷V2)
=0.0208×(ΔA+0.0192)
V1：加入反应体系中样本体积，0.035mL；V2：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g；500：细菌或细胞总数，500 万。
b.用96孔板测定的计算公式如下
标准条件下测定回归方程为y =0.0479x-0.0192；x为标准品浓度（mg/mL），y为吸光值。
(1) 按蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白每小时产生1mg还原糖定义为一个酶活性单位。
β-1,3-GA(mg/h/mg prot)= [(ΔA +0.0192)÷0.0479×V1]÷(V1×Cpr)
=20.876×(ΔA +0.0192)÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织每小时产生1mg还原糖定义为一个酶活性单位。
β-1,3-GA(mg/h/g 鲜重)= [(ΔA +0.0192)÷0.0479×V1]÷(W×V1÷V2)
= 20.876×(ΔA +0.0192)÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞每小时产生1mg还原糖定义为一个酶活性单位。
β-1,3-GA(mg/h /104cell)= [(ΔA +0.0192)÷0.0479×V1]÷(500×V1÷V2)
=0.0416×(ΔA+0.0192)
V1：加入反应体系中样本体积，0.035mL；V2：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g；500：细菌或细胞总数，500 万。
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