人高迁移率族蛋白B1(HMGB-1)ELISA试剂盒

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ELISA实验标本的采集、处理和保存

R&D elisa试剂盒样本处理及要求

1.  血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20 分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
2.  血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃ 1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
3.  组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4.  细胞培养物上清或其它生物标本：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

 

R&D elisa试剂盒需要而未提供的试剂和器材

1. 酶标仪（450nm）

2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒温箱

4. 蒸馏水或去离子水

 

elisa试剂盒试剂盒组成

 

名称	96孔配置	48孔配置	备注
微孔酶标板	12孔×8条	12孔×4条	无
标准品	0.3mL*6管	0.3mL*6管	无
样本稀释液	6mL	3mL	无
检测抗体-HRP	10mL	5mL	无
20×洗涤缓冲液	25mL	15mL	按说明书进行稀释
底物A	6mL	3mL	无
底物B	6mL	3mL	无
终止液	6mL	3mL	无
封板膜	2张	2张	无
说明书	1份	1份	无
自封袋	1个	1个	无

备注：

  经过大量正常标本检验，标本的正常浓度值均在试剂盒提供的检测范围内，实验过程中直接取50μL样本上样即可。当有部分样本值超过最大标准品浓度时，可用样本稀释液将标本进行适当稀释后再进行实验。

 

R&D elisa试剂盒注意事项

1. 严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室温20-25℃。使用后立即冷藏保存试剂。

2. 洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。

3. 消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4. 底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。

5. 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6. 在储存和温育时避免强光直接照射。

7. 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8. 任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反应试剂的生物活性。

9. 不能使用过期产品。

10. 如果可能传播疾病，所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置。

 

R&D elisa试剂盒试剂准备

试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡后方可使用。

20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份20×洗涤缓冲液加19份蒸馏水。

 

R&D elisa试剂盒操作步骤

1.  从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.  设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.  样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.  除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.  弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.  每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.  每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

 

实验结果计算

以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。

 

能够应用ELISA 实验的样本种类很多，有血清，血浆，细胞上清，细胞裂解液，尿液，关节滑液，脑脊液，肺泡灌洗液，各种组织的组织匀浆；采集和处理的方式都不相同。下面就列出了biotnt 收集的给类样本的采集、处理和保存方式。方法大多出自文献和试剂盒说明书，部分方法经Biotnt 验证过，但有的方法并没有实际操作过，所以，以下方法仅供参考。

 

 

一、ELISA实验中血清的采集、处理和保存；

1、 真空采血针采集2ml新鲜血液，加入无菌试管中；

2、 采血后室温静置1小时；

3、 将采集血液用离心机4℃，2500rpm离心10min，，将离心好的匀浆留上清，弃下面沉淀。

4、 取上清。 分装冻存备用，

2-8℃下，可放置保存24-48小时；

-20℃下，可放置保存1个月；

-70℃下，可放置保存6个月；

5、 根据你的实验需要，取适量上清夜进行各种ELISA测定。 

大部分ELISA检测均以血清为标本。血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的 ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。此外还应避免细菌污染，因为菌体中可能含有含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。血清标本宜在新鲜 时检测。如在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，在间接法ELISA中可使本底加深。

 

二、ELISA实验中血浆的采集、处理和保存；

1、 真空采血针采集2ml新鲜血液，加入无菌试管中；

2、 按1:9加入抗凝剂（EDTA、草酸钠、肝素、枸橼酸钠），30分钟内于冰上分离血浆以减少血小板的污染；（也可以直接用抗凝管采集）；

3、 将采集血液用离心机4℃，2500rpm离心5min，，将离心好的匀浆留上清，弃下面沉淀。

4、 取上清。 分装冻存备用，

2-8℃下，可放置保存24-48小时；

-20℃下，可放置保存1个月；

-70℃下，可放置保存6个月；

5、 根据你的实验需要，取适量上清夜进行各种ELISA测定。 请注意指标说明书上对于抗凝血剂是否有特殊要求，建议使用EDTA。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份均同等于血清。

注意事项：制备血浆标本需借助于抗凝剂EDTA,抗凝不完全的标本因纤维蛋白原干扰而造成假阳性。

 

三、ELISA 实验中尿液的采集、处理和保存；

1、 采集尿液样本500ul，加入无菌试管中；

2、 将采集血液用离心机4℃，2500rpm离心10min，，将离心好的样本留上清，弃下面沉淀。

3、 取上清。 分装冻存备用，

2-8℃下，可放置保存24-48小时；

-20℃下，可放置保存1个月；

-70℃下，可放置保存6个月；

4、 根据你的实验需要，取适量上清夜进行各种ELISA测定。

 

四、ELISA 实验中脑脊液的采集、处理和保存；

1、采集脑脊液样本，加入无菌试管中；

2、将采集血液用离心机4℃，2500rpm离心10min，，将离心好的样本留上清，弃下面沉淀。

3、取上清。 分装冻存备用，

2-8℃下，可放置保存24-48小时；

-20℃下，可放置保存1个月；

-70℃下，可放置保存6个月；

4、根据你的实验需要，取适量上清夜进行各种ELISA测定。

 

五、ELISA 实验中细胞上清液的采集、处理和保存；

1、采集细胞培养上清液500ul，加入无菌试管中；

2、将采集血液用离心机4℃，2500rpm离心10min，，将离心好的匀浆留上清，弃下面沉淀。

3、取上清。 分装冻存备用，

2-8℃下，可放置保存24-48小时；

-20℃下，可放置保存1个月；

-70℃下，可放置保存6个月；

4、根据你的实验需要，取适量上清夜进行各种ELISA测定。

 

六、ELISA 实验中细胞裂解液的采集、处理和保存；（需要测蛋白浓度）

1、 取细胞培养板或细胞悬液，用PBS（PH7.2-7.4）洗涤细胞培养板1-2次。

2、 通过反复冻融或加入组织蛋白萃取试剂（裂解液），使细胞破坏并放出细胞内成份。

3、 将采集血液用离心机4℃，2500rpm离心20min，，将离心好的匀浆留上清，弃下面沉淀。

4、 取上清。 分装冻存备用，

2-8℃下，可放置保存24-48小时；

-20℃下，可放置保存1个月；

-70℃下，可放置保存6个月；

5、 根据你的实验需要，取适量上清夜进行各种ELISA测定。