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B16小鼠黑色素瘤细胞

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基本参数

品牌 语纯生物 产地 上海
经营模式 自产自销 贮存 常温
售后周期 一周 运输方式 顺丰发货
货期 现货

细胞在体外进行培养,失去了机体的调节和控制。因此,除满足营养的要求外,还必须使细胞生存环境尽量接近活体的环境。外环境的培养条件如温度、渗透压、酸碱度等均能影响细胞的生长。

    一、温度1640.jpg

   一般哺乳类及禽类细胞体外培养的适宜温度是37~38℃。温度过高或过低都会影响到细胞的生长。细胞耐受低温的能力比抗热的能力强,在低温下,细胞的代谢活力及核分裂降低。温度不低于0℃时,虽影响细胞代谢,但并无伤害作用;把细胞置于25~35℃时,细胞仍能生存和生长,但速度减缓;放在40℃数小时后,再置回37℃培养细胞仍能继续生长。但如果在40℃下暴露时间太长,对细胞生长不利,甚至变圆脱落于瓶壁。若温度过低,在降到冰点以下时,细胞因胞外水和胞质结冰而受损死亡。但若向培养液中加入甘油或二甲亚砜等保护剂,封入安瓿中后,置于液氮中,可起保护作用,此时细胞可耐受-70℃以下温度,能长期储存,解冻后细胞复苏,仍能继续生长增殖,细胞生物性状不受任何影响。此为保存细胞的主要手段。

   高温对细胞培养不利。细胞在39~40℃培养1小时,能受到一定损伤,但仍有可能恢复,但不能忍受温度再升高2℃,持续数小时,即在41~42℃中培养1小时,细胞损伤严重,温度至43℃以上时细胞多数被杀死。高温主要引起酶的灭活、类脂质破坏,核分裂的破坏,产生凝固酶使细胞发生凝固,另外使蛋白质变性。因此,体外培养细胞时一定要避免高温。

   二、气体环境和pH

   体外培养细胞需要理想的气体环境,氧和二氧化碳是细胞生存必须的条件之一。氧参加细胞的三羧酸循环,产生能量以供给细胞生长、增殖和合成各种所需成分。有些细胞在低氧条件下,可借糖酵解取得能量,但多数细胞低氧时不能生存。氧张力通常维持在略低于大气状态,若氧分压超过大气中氧的含量可能对有些细胞有害。采用开放式培养时(碟皿或培养瓶松盖培养或培养板培养),一般要把细胞置于95%空气加5%二氧化碳的混合气体环境中。

   CO2既是细胞的代谢产物,又是细胞生长所必需的成分,并与维持培养液的pH有关。在密闭瓶中CO2浓度偏低的情况下,细胞容易生长;一般不能低于1%,否则有损细胞。CO2增加将使pH下降。大多数细胞适于在pH7.2~ pH 7.4条件下生长,低于pH6.8或高于pH7.6对细胞有害,甚至退变或死亡。各种细胞对pH的要求不尽相同。一般原代培养细胞对pH的变动耐受性差,永生性细胞系和恶性细胞对pH的变动耐力强。但总的来说,细胞对碱性不如对酸性的变化耐受,偏酸的条件比偏碱的环境对细胞生长有利。细胞在生长过程中随细胞数量的增多和代谢活动的加强,不断释放CO2,使培养基变酸,pH发生变化。所以,为了维持培养环境恒定的pH,多采用在培养液中加入磷酸盐等缓冲剂的方法。磷酸缓冲剂中的NaHCO3可供给CO2,但CO2易于逸出,故只适用于封闭式培养。若开放式培养还是置于含有5%CO2的气体环境中为宜。为克服NaHCO3调整的麻烦,也可用羟乙基哌嗪乙硫磺酸(N-2-hydroxyethyl piperazine-N'-ethanesulfonic acid, Hepes),它对细胞无毒性,也不起缓冲作用,主要作用是防止pH迅速变动,在开瓶通气培养或活细胞观察时能维持较恒定的pH。细胞通用图片1.jpg

    三、渗透压

   细胞在高渗溶液或低渗溶液中,可以立即发生皱缩或肿胀、破裂。所以,渗透压是体外培养细胞的重要条件之一。哺乳动物和其他动物组织细胞体外培养的渗透压的维持主要与NaCl有关,但不能忽视其他电介质渗透压的关系。渗透压与单位体积溶媒内溶质的分子数和离子数成正比。为此,按一定比例控制培养液中离子平衡,维持正常渗透压是很重要的。这不仅是为了维持细胞张力,而且是为了调节细胞的代谢。因为细胞外离子输送和离子浓度改变着其他营养物质的输送(如氨基酸、蔗糖等),直接影响细胞基本合成系统。

   理想的渗透压因细胞的类型及种族而异,人血浆渗透压为290mmol/L,被视为是体外培养人类细胞的理想渗透压。哺乳类动物细胞的渗透压一般为290~300mmol/L。人胚肺成纤维细胞为250~325mmol/L,鼠则为310mmol/L左右。在实际应用中,260~320mmol/L的渗透压可适于大多数细胞。

   四、辐射线和超声波

    (一)可见光

   可见光的波长是3900~7800?。可见光的各种有色光能引起细胞退变,延长核分裂的间期,还可显著降低细胞的附壁能力。因此,体外培养细胞应避免日光直接照射,最好在黑暗中进行培养或短期存放。

    (二)紫外线

   弱紫外线下耐受能力强的细胞变化不大,但对敏感的细胞有损害。紫外线强时,新分离的细胞显示:不能进行完全的有丝分裂;在有丝分裂时增加了脱水收缩;在有丝分裂时细胞质的起泡减少。Elrlich腹水癌细胞经紫外线照射后,用飞点紫外线显微镜观察发现被照射表面形成水泡,随后细胞膨胀,损害也渐变严重。

 

 筛选稳定细胞株的两种方法
       1、转染质粒后,单克隆方法筛选稳定细胞系
       对大多数细胞转染效率较低。对于基因过表达,如果转染效率达到40%,基因过表达尚可。但是对于基因干扰实验,对转染效率要求远远高于基因过表达,通常质粒转染无法满足。
       另外,质粒游离于细胞质中,很快降解,无法满足较长时间的检测项目;质粒转染整合几率极低,稳定细胞株构建耗时耗力,且得率很低,往往需要挑取单克隆株。
       2、病毒感染筛选稳定细胞株
       病毒感染方法较质粒转染筛选单克隆方法更方便和高效,是目前主流的稳定细胞系筛选方法。用慢病毒制备稳转细胞株,由于其高效整合、高效转录、高效表达、宿主范围广,感染效率高,且与细胞染色体整合而不发生基因重排,是制备稳定细胞株的理想载体。
       稳定转染细胞株服务流程
      1、载体构建:将外源基因构建到合适的载体上,如需病毒转染,则包装病毒。
      2、筛选浓度测定:以 10-14 天细胞全部死亡的抗生素浓度为筛选浓度。
      3、细胞接种:转染实验前天接种细胞,各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定。进行转染当天细胞应达到 60%-80% 覆盖。
      4、细胞转染:用构建好的载体(或包装好的病毒)转染目的细胞。
      5、抗生素筛选。
      6、鉴定筛选结果。
     最终交付
     1、病毒滴度检测报告;稳转细胞株;
     2、结题报告,包括详细的实验流程,测序结果和峰图、引物序列、载体图谱和滴度测定报告和q-P

 


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