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葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOD)试剂盒说明书
可见分光光度法
正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义
GOD(EC 1.1.3.4)广泛存在于动物、和植物中,催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸,并产生H2O2 ,是生物体中产生活性氧的代谢途径之一。
测定原理
GOD催化产生H2O2,过氧化物酶在有氧存在时催化H2O2分解产生的氧又将邻联茴香胺氧化生成有色物质,颜色深浅与葡萄糖氧化酶活性成线性关系。
试验中所需的仪器和设备
可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL 玻璃比色皿、研钵、冰、蒸馏水
试剂的组成和配制
提取液:液体60mL×1 瓶,4℃保存;
试剂一:液体40mL×1 瓶,4℃保存;
试剂二:液体8mL×1 瓶,4℃保存;
试剂三:液体2mL×1 支,4℃保存;
样品测定的准备
组织处理:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
血清(浆):直接检测。
测定步骤
1、分光光度计预热 30min以上,调节波长至500nm,蒸馏水调零。
2、GOD检测工作液的配制:用时将试剂二和试剂三转移至试剂一中,充分混匀,待用;用不完的试剂 4℃可保存一周;
3、测定前将 GOD 检测工作液在37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴10min 以上。
4、在1mL玻璃比色皿中加入 40μL 样本和 960μL 工作液,立即混匀并计时,记录 500nm下20s吸光值A1和1min20s 后的吸光值 A2。计算 ΔA=A2-A1。
GOD 活力单位的计算
1、血清(浆)GOD 活力的计算
单位定义:每 mL 血清(浆)每分钟催化产生 1nmol 氧化型邻联茴香胺为一个酶活力单位。
GOD(nmol/min/mL)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷V 样÷T=3333×ΔA
2、动物组织 GOD 活力的计算
(1)按蛋白浓度计算
单位定义:每 mg组织蛋白每分钟催化产生 1nmol 氧化型邻联茴香胺为一个酶活力单位。
GOD(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr)÷T
=3333×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
单位定义:每 g 组织每分钟催化产生 1nmol 氧化型邻联茴香胺为一个酶活力单位。
GOD(nmol/min/ g鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总)÷T
=3333×ΔA÷W
V 反总:反应体系总体积,1×10-3 L;ε:氧化型邻联茴香胺摩尔消光系数,7.5×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.04 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,1 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g。
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