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上海优选生物科技有限公司
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二胺氧化酶（Diamine Oxidase，DAO）试剂盒说明书
微量法
注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
DAO(EC1.4.3.6)广泛存在于动物（肠粘膜、肺、肝脏、肾脏等）、植物和微生物中。催化多胺氧化为醛，其活性与核酸和蛋白合成密切相关，能够反映肠道机械屏障的完整性和受损伤程度。
测定原理：
DAO催化尸胺产生醛和过氧化氢，外源添加过量的辣根过氧化物酶，催化过氧化氢氧化邻
联茴香胺生成氧化型邻联茴香胺，在460nm处有特征吸收峰，通过测定该波长吸光度增加速率，计算DAO活性。
自备实验用品及仪器：
天平、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、蒸馏水。
试剂组成和配制：
提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：液体 0.25mL×1 支，4℃保存。
试剂二：液体 2mL×1 管，4℃保存。
试剂三：液体 1mL×1 管，4℃保存。
粗酶液提取：
1. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃离心20min，取上清，置冰上待测。
2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
3. 血清等液体：直接测定。
测定操作表：
1、分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长至460nm，蒸馏水调零。
2、操作表
对照管 |
测定管 |
|
粗酶液（μL） |
50 |
50 |
提取液（μL） |
128 |
108 |
试剂一（μL） |
2 |
2 |
试剂二（μL） |
20 |
20 |
试剂三（μL） |
20 |
|
混匀，37℃水浴30min，微量石英比色皿/96孔板，蒸馏水调零，测定460nm吸光值。 ΔA=A测定-A 对照。 |
||
酶活性计算公式：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
（1）按样本蛋白浓度计算：
酶活性定义：在pH7.2，温度为37℃条件下，每毫克组织蛋白每分钟催化产生1nmol H2O2所需的酶量为一个酶活力单位（U）。
DAO 活性（nmol/min/mg prot）=A460÷（ε×d）×V 反总÷（V 样×Cpr）÷T
= 18×A 460 ÷Cpr
（2）按样本质量计算：
酶活性定义：在pH7.2，温度为37℃条件下，每克组织每分钟催化产生1nmol H2O2所需的酶量定义为一个酶活力单位。
DAO 活性（nmol/min/g）=A460÷（ε×d）×V 反总÷（V 样÷V 样总×W）÷T
= 18×A 460 ÷W
（3）按细胞数量计算：
酶活性定义： 在pH7.2，温度为37℃条件下，每104个细胞每分钟催化产生1nmol H2O2所需的酶量定义为一个酶活力单位。
DAO 活性（nmol/min/104cell）=A460÷（ε×d）×V 反总÷（V 样÷V 样总×细胞数量）÷T= 18×A460 ÷细胞数量
(4) 按液体体积计算
酶活性定义： 在pH7.2，温度为37℃条件下，每毫升血清每分钟催化产生1nmol H2O2所需的酶量定义为一个酶活力单位。
DAO 活性（nmol/min/mL）=A460÷（ε×d）×V 反总÷V 样÷T= 18×A460
ε：氧化型邻联茴香胺毫摩尔消光系数：7.5 L/mmol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反
应总体积，0.2mL；V 样：反应中样本体积，0.05mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：
样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，30min
b. 用 96 孔板测定的计算公式如下
（1）按样本蛋白浓度计算：
酶活性定义：在pH7.2，温度为37℃条件下，每毫克组织蛋白每分钟催化产生1nmol H2O2所需的酶量为一个酶活力单位（U）。
DAO 活性（nmol/min/mg prot）=A460÷（ε×d）×V 反总÷（V 样×Cpr）÷T
= 36×A 460 ÷Cpr
（2）按样本质量计算：
酶活性定义：在pH7.2，温度为37℃条件下，每克组织每分钟催化产生1nmol H2O2所需的酶量定义为一个酶活力单位。
DAO 活性（nmol/min/g）=A460÷（ε×d）×V 反总÷（V 样÷V 样总×W）÷T
= 36×A460÷W
（3）按细胞数量计算：
酶活性定义： 在pH7.2，温度为37℃条件下，每104个细胞每分钟催化产生1nmol H2O2所需的酶量定义为一个酶活力单位。
DAO 活性（nmol/min/104cell）=A460÷（ε×d）×V 反总÷（V 样÷V 样总×细胞数量）÷T= 36×A460÷细胞数量
(4) 按液体体积计算
酶活性定义：在pH7.2，温度为37℃条件下，每毫升血清每分钟催化产生1nmol H2O2所需的酶量定义为一个酶活力单位。
DAO 活性（nmol/min/mL）=A460÷（ε×d）×V 反总÷V 样÷T= 36×A460
ε ：氧化型邻联茴香胺毫摩尔消光系数：7.5 L /mmol/cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V 反总：
反应总体积，0.2mL；V 样：反应中样本体积，0.05mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，30min
注意事项：
1、如果OD值小于0.01，适当加大提取用样本量；OD值大于0.8，粗酶液可适当稀释，或者减少提取用样本量。
2、样品蛋白质含量需要另外测定。
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