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上海优选生物科技有限公司
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谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS)试剂盒说明书
微量法
产品内容:
提取液:100mL×1 瓶,4℃保存。
试剂一:10mL×1 瓶,-20℃保存。
试剂二:10mL×1 瓶,-20℃保存。
试剂三:粉剂×2 瓶,-20℃保存。用时每瓶加入5mL蒸馏水充分溶解备用,用不完的试剂仍-20℃保存。
试剂四:15mL×1 瓶,4℃保存。
产品说明:
GS(EC 6.3.1.2)主要存在于植物中,是生物体内氨同化的关键酶之一,催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺,不仅可以防止过多的铵离子对生物有毒性,而且谷氨酰胺也是氨的主要储存和运输形式。
GS 在ATP 和Mg2+存在下,催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺;谷氨酰胺进一步转化为γ─谷氨酰基异羟肟酸,在酸性条件下与铁形成红色的络合物;该络合物在540nm 处有最大吸收峰,可用分光光度计测定。
所需的仪器和用品:
可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本测定的准备
1、 细菌、细胞或组织样品的制备:
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为500~1000:1 的比例(建议500 万细菌或细胞加入1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30 次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10 的比例(建议称取约0.1g 组织,加入1mL 提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2、 血清(浆)样品:直接检测。
二、测定步骤
1、 分光光度计预热30min 以上,调节波长至540nm,蒸馏水调零。
2、 在EP 管中加入下列试剂:
试剂名称(μL) |
测定管 |
对照管 |
试剂一 |
160 |
|
试剂二 |
160 |
|
试剂三 |
70 |
70 |
样本 |
70 |
70 |
混匀,37℃(哺乳动物)或25℃(其他物种)准确水浴30min |
||
试剂四 |
100 |
100 |
混匀,静置10min后,8000g,常温离心10min,取200μL上清至微量石英比色皿或96孔板中,测定540nm 处的吸光值A。△A=A测定管-A 对照管。每个测定管需设一个对照管。
GS 活力单位的计算
a.用微量石英比色皿测定计算公式如下:
1. 血清(浆)GS活性
单位定义:每mL血清(浆)在每mL反应体系中每min使540下吸光值变化0.01定义为一个酶活力单位。
计算公式:GS(U/mL)=ΔA×V 反总÷V 样÷0.01÷T =19×ΔA
2. 组织、细菌或细胞GS 活性
(1) 按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白在每mL反应体系中每min使540nm下吸光值变化0.01定义为一个酶活力单位。
GS(U/mg prot)=ΔA×V 反总÷(Cpr×V 样)÷0.01÷T =19×ΔA÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算:
单位的定义:每g组织在每mL反应体系中每min使540nm下吸光值变化0.01定义为一个酶活力单位。
GS(U/g 鲜重)=ΔA×V 反总÷(W×V 样÷V 样总)÷0.01÷T =19×ΔA÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
单位定义:每1万个细菌或细胞在每mL反应体系中每min使540nm下吸光值变化0.01定义为一个酶活力单位。
GS(U/104 cell)=ΔA×V 反总÷(500×V 样÷V 样总)÷0.01÷T =0.038×ΔA
V 反总:反应体系总体积,0.4mL;V 样:加入样本体积,0.07mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,30 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。
b. 用96孔板测定的计算公式如下
1、 血清(浆)GS 活性
单位定义:每mL 血清(浆)在每mL 反应体系中每min使540下吸光值变化0.005定义为一个酶活力单位。
计算公式:GS(U/mL)=ΔA×V 反总÷V 样÷0.005÷T =38×ΔA
2、 组织、细菌或细胞GS 活性
(1) 按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg 组织蛋白在每mL反应体系中每min使540nm下吸光值变化0.005定义为一个酶活力单位。
GS(U/mg prot)=ΔA×V 反总÷(Cpr×V 样)÷0.005÷T =38×ΔA÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算:
单位的定义:每g组织在每mL反应体系中每min使540nm下吸光值变化0.005定义为一个酶活力单位。
GS(U/g 鲜重)=ΔA×V 反总÷(W× V 样÷V 样总)÷0.005÷T =38×ΔA÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
单位定义:每1万个细菌或细胞在每mL 反应体系中每min使540nm下吸光值变化0.005定义为一个酶活力单位。
GS(U/104cell)=ΔA×V 反总÷(500×V 样÷V 样总)÷0.005÷T =0.076×ΔA
V 反总:反应体系总体积,0.4mL; V 样:加入样本体积,0.07mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,30 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。
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