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丙转氨酶(GPT)活性测定试剂盒说明书
可见分光光度法
正式测定前务必取2-3 个预期差异较大的样本做预测定
产品内容:
提取液:液体30mL×1 瓶,4℃保存。
试剂一:液体5mL×1 瓶,4℃保存;
试剂二:液体5mL×1 瓶,4℃保存;
试剂三:液体50 mL×1 瓶,4℃保存;
产品说明:
GPT(EC 2.6.1.2)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,催化氨基酸和酮酸转氨基反应,在氨基酸代谢中具有重要作用。此外,哺乳动物肝细胞GPT 活性很高,当肝细胞坏死,GPT 释放到血液中,血清GPT 活性显著增高。因此,GPT 被世界卫生组织推荐为肝功能损害最敏感的检测指标。
GPT 催化丙氨酸和α-酮戊二酸发生转氨基反应,生成丙酮酸和谷氨酸;加入2,4-二硝基苯肼溶液,不仅终止上述反应,而且与酮酸中的羰基加成,生成丙酮酸苯腙;苯腙在碱性条件下呈红棕色,可以在505nm 读取吸光值并计算酶活力。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样品测定的准备
细菌、细胞或组织样品的制备:
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为500~1000:1 的比例(建议500 万细菌或细胞加入1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30 次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10 的比例(建议称取约0.1g 组织,加入1mL 提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
血清(浆)样品:直接检测。
二、测定操作表
分光光度计预热30min 以上,调节波长至505nm,蒸馏水调零。
在EP 管中加入下列试剂
试剂名称(μL) |
测定管 |
对照管 |
待测样本 |
20 |
|
试剂一 |
100 |
100 |
混匀后,37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热30min |
||
试剂二 |
100 |
100 |
待测样本 |
20 |
|
混匀后,37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)准确水浴20min |
||
试剂三 |
1000 |
1000 |
混匀,室温放置10min,在505nm 波长处,测各管吸光度。每个测定管需设一个对照管。
三、计算
以相对吸光值(A 测定管-A 对照管)为横坐标,相应酶活力单位(U/L)为纵坐标。作标准曲线为:y=(605.07χ2+192.86χ+0.1392)×0.482
血清中GPT 活力(U/L)= 0.482×(605.07χ2+192.86χ+0.1392)。χ 为A 测定管-A 对照管。
微生物、细胞或组织中GPT 活力(U/g 蛋白)=0.482×(605.07χ2+192.86χ+0.1392)÷待测匀浆蛋白浓度(g/L)。χ 为A 测定管-A 对照管。
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