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上海优选生物科技有限公司
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丙酮酸(pyruvic acid PA)含量测定试剂盒说明书
微量法
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
丙酮酸通过乙酰 CoA 连接葡萄糖、脂肪酸和氨基酸三大代谢,起着重要的枢纽作用。
测定原理:
丙酮酸与 2,4-二硝基苯肼作用,生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙,在碱性溶液中呈显色。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰、蒸馏水。
试剂的组成和配制:
提取液:液体 100mL×1 瓶,4℃保存;
试剂一:液体 2.5mL×1 瓶,4℃保存;
试剂二:液体 12.5mL×1 瓶,4℃保存。
丙酮酸提取:
1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎(冰浴,功率 20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次),静置30min,8000g,25℃离心 10min,取上清待测。
2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1m 提取液),进行冰浴匀浆,静置 30min,8000g,25℃离心 10min,取上清待测。
3、血清(浆)样品:按照血清(浆)体积(mL):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议取0.1mL血清(浆)加入1mL 提取液),进行冰浴匀浆,静置30min, 8000g,25℃离心10min, 取 上清待测。
测定步骤:
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至520nm,蒸馏水调零。
2、在微量石英比色皿或96孔板中加入75μL样本和25μL试剂一,混匀,静置2min,加入125μL试剂二,混匀,于520nm 波长处测定管吸光值 A。
丙酮酸含量计算:
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、标准条件下测定回归方程为 y = 0.0466x + 0.0675;x 为丙酮酸钠含量(μg/mL),y 为吸光值。
2、按照血清(浆)体积计算
丙酮酸含量(μg/mL)= [(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷(V3×V1÷V2)=214.6×(A-0.0675)
3、按照蛋白浓度计算
丙酮酸含量(μg/mg prot)=[(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷(V1×Cpr)
=21.46×(A-0.0675) ÷Cpr
4、按照样品质量计算
丙酮酸含量(μg/g 鲜重)= [(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷(W ×V1÷V2)
=21.46×(A-0.0675) ÷W
5、按照细菌或细胞密度计算
丙酮酸含量(μg/104cell)=[(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷(500×V1÷V2)
=0.043×(A-0.0675)
V1:加入反应体系中样本体积,0.075mL;V2:加入提取液体积,1 mL;V3:加入血清(浆)
体积,0.1 mL; Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,
500 万。
b.用96孔板测定的计算公式如下
1、标准条件下测定回归方程为 y = 0.0233x+0.0675;x为丙酮酸钠含量(μg/mL),y 吸光值。
2、按照血清(浆)体积计算
丙酮酸含量(μg/mL)= [(A-0.0675)÷0.0233×V1]÷(V3×V1÷V2)=429.2×(A-0.0675)
3、按照蛋白浓度计算
丙酮酸含量(μg/mg prot)=[(A-0.0675)÷0.0233×V1]÷(V1×Cpr)
=42.92×(A-0.0675) ÷Cpr
4、按照样品质量计算
丙酮酸含量(μg/g 鲜重)= [(A-0.0675)÷0.0233×V1]÷(W ×V1÷V2)
=42.92×(A-0.0675) ÷W
5、按照细菌或细胞密度计算
丙酮酸含量(μg/104cell)=[(A-0.0675)÷0.0233×V1]÷(500×V1÷V2)
=0.086×(A-0.0675)
V1:加入反应体系中样本体积,0.075mL;V2:加入提取液体积,1 mL;V3:加入血清(浆)体积,0.1 mL; Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。
注意:最低检测限为 100μg/mL 或 100μg/g 鲜重或 1μg/mg prot
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