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上海优选生物科技有限公司
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乳酸含量(lactic acid ,LA )试剂盒说明书
可见分光光度法
注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义
乳酸是生物体代谢过程中重要的中间产物,与糖代谢、脂类代谢、蛋白质代谢及细胞内能量代谢密切相关,乳酸含量是评估糖元代谢的和有氧代谢的重要指标。
测定原理
乳酸在乳酸脱氢酶的作用下生成丙酮酸,同时使NAD+还原生成NADH和H+,H+传递给PMS生成的PMSH2还原INT生成红色物质,在530nm处有特征吸收峰。
自备实验用品及仪器
天平、研钵、离心机、可见分光光度计、1mL玻璃比色皿、恒温水浴锅。
试剂组成和配制
提取液:液体 55mL×1 瓶,4℃保存。
试剂一:液体 8mL×1 瓶,4℃保存。
试剂二:液体 12mL×1 瓶,4℃保存。
试剂三:粉剂×1 支,-20℃避光保存。临用前加入1.2mL蒸馏水充分溶解。
试剂四:粉剂×1 瓶,4℃避光保存。临用前加12mL蒸馏水充分溶解。
试剂五:粉剂×1 支,4℃避光保存。
标准品:液体 1mL×1 支,4℃保存。
显色液:临用前根据用量按照提取液(V):试剂三(V):试剂四(V):试剂五(m)=1:
0.3:3:15(mg)的比例充分混匀。
样本处理
1. 组织:按照质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g,加入1mL提取液)加入提取液,冰浴匀浆后于4℃,12000g离心10min,取上清测定。
2. 细胞:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);于 4℃,12000g 离心10min,取上清测定。
3. 血清:直接测定。
测定操作
空白管 |
样品对照管 |
样品测定管 |
标准对照管 |
标准测定管 |
|
样品(μL) |
50 |
50 |
|||
标准品(μL) |
50 |
50 |
|||
H2O(μL) |
500 |
300 |
450 |
300 |
450 |
试剂一(μL) |
150 |
150 |
|||
试剂二(μL) |
200 |
200 |
200 |
200 |
200 |
显色液(μL) |
300 |
300 |
300 |
300 |
300 |
充分混匀,于 37℃反应 30min,于 1mL 玻璃比色皿,空白管调零,测定 530nm 处吸光值, 分别记为 A1,A2,A3,A4,△A 样=A2-A1;△A 标= A4-A3 |
注意:空白管、标准对照管和标准测定管只需测定一次
计算公式
1. 按照蛋白含量计算
LA 含量(μmol/mg prot)=△A 样÷△A 标×C 标÷ Cpr
=2×△A 样÷△A 标÷ Cpr
2. 按照样本质量计算
LA 含量(μmol/g)=△A 样÷△A 标×C 标÷ W
=2×△A 样÷△A 标÷ W
3. 按照细胞数量计算
LA 含量(μmol/104cell)=△A 样÷△A 标×C 标÷ 细胞数量
=2×△A 样÷△A 标÷ 细胞数量
4. 按照液体体积计算
LA 含量(μmol/mL)=△A 样÷△A 标×C 标
=2×△A 样÷△A 标
C 标:标准品浓度,2mmol/L ;W:样本质量,g/mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL
注意事项
1. 空白管、标准对照管、标准测定管只需做一次。
2. 若吸光值超过 1.2,请进行适当的稀释后再进行测定,并在计算公式中乘以稀释倍数。
3. 最低检出限为 1.8μmol/L。数,500 万。
上海优选生物科技有限公司
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伍雅君
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