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3-磷酸甘油酸激酶(PGK)测试盒 试剂盒

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基本参数

品牌 优选生物/Sinobestbio 产地 上海
产品等级 优级品 产品用途 检测试剂
用途 生化检测 产品规格 50管/48样100管/96样

3- 磷酸甘油酸激酶

3-Phosphoglycerate kinase,PGK)试剂盒说明书

紫外分光光度法

注意:正式测定之前选择 2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

3-磷酸甘油酸激酶是糖酵解的关键酶,广泛存在于动植物和微生物体内,催化1,3-二磷酸甘油酸转变为3-磷酸甘油酸,产生1分子ATP,具有影响DNA复制和修补及刺激病毒RNA合成等生物学功能,广泛应用于药物靶标设计。

测定原理

3-磷酸甘油酸激酶催化3-磷酸甘油酸和ATP产生1,3-二磷酸甘油酸和ADP,1,3-二磷酸甘油酸在 3-磷酸甘油醛脱氢酶和NADH作用下产生3-磷酸甘油醛、NAD和磷酸,340nm处的吸光度变化反映了3-磷酸甘油酸激酶的活性的高低。

自备实验用品及仪器

天平、低温离心机、研钵、紫外分光光度计、1 mL 石英比色皿。

试剂组成和配制

提取液:液体50mL×1 瓶,4℃保存。

试剂一:液体25mL×1 瓶,4℃避光保存。

试剂二:粉剂×1 瓶,-20℃避光保存。临用前加5mL蒸馏水充分溶解。

试剂三:粉剂×1 瓶,-20℃避光保存。临用前加2.5mL蒸馏水充分溶解。

试剂四:粉剂×1 瓶,-20℃避光保存。临用前加2.5mL蒸馏水充分溶解。

试剂五:粉剂×1 瓶,-20℃避光保存。临用前加10mL蒸馏水充分溶解。

酶液提取

1. 组织:按照质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约0.1g,加入1mL

提取液)加入提取液,冰浴匀浆后于 4℃,10000g 离心 10min,取上清置冰上待测。

2. 细胞:按照细胞数量(10 4 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议500

万细胞加入1mL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间 3min);然后 4℃,10000g 离心 10min,取上清置冰上待测。

3. 液体:直接检测。

测定操作

1. 分光光度计预热30min,调节波长至340nm,蒸馏水调零。

2. 取1mL石英比色皿,依次加入500μL试剂一,100μL试剂二,50μL试剂三,50μL试剂四,200μL试剂五,100μL粗酶液,充分混匀,记录340nm 处10s的吸光值A1和310s的吸光值 A2,△A=A1-A2

 

 

 

 

计算公式

1)按照样本蛋白浓度计算

酶活单位定义:每毫克组织蛋白每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

PGK(nmol/min /mg prot)=ΔA÷(ε×d)×V 反总÷(V 样×Cpr) ÷T

=321.54×ΔA÷Cpr

2)按照样本质量计算

酶活单位定义:每克组织每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

PGK(nmol/min /g)=ΔA÷(ε×d)×V 反总÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T

=321.54×ΔA÷W

3)按照细胞数量计算

酶活单位定义:每 104个细胞每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

PGK(U/104cell)= ΔA÷(ε×d)×V 反总÷(V 样×细胞数量÷V 样总) ÷T

=321.54×ΔA÷细胞数量

4)按照液体体积计算

酶活单位定义:每毫升液体每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

PGK(nmol/min /mL)=ΔA÷(ε×d)×V 反总÷V 样÷T=321.54×ΔA

V 反总:反应体系总体积,1mL;ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×103 L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.1mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g

注意事项

配制好的试剂二、试剂三、试剂四、试剂五3天内使用完。

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