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上海优选生物科技有限公司
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脂肪酶(Lipase ,LPS )活性试剂盒说明书
可见分光光度法
测定意义:
LPS 又称甘油酯水解酶,催化甘油三酯水解生成脂肪酸和甘油(或者甘油二酯和单酯)。LPS广泛的存在于各种生物中。血清中 LPS 的异常增高常见于胰腺炎和胰腺癌。
测定原理:
LPS 催化油酯水解成脂肪酸,利用铜皂法测定脂肪酸生成速率,即可计算 LPS 活性。
自备 仪器和用品:
研钵、台式离心机、震荡混匀器、可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿、可调式移液枪、 甲
苯、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制:
试剂一:液体×1 瓶,4℃保存。
试剂二:液体×1 瓶,室温保存。
试剂三:液体×1 瓶,4℃保存。
标准品×1 瓶,10μmol/mL的标准溶液,室温保存。临用前加入3.168 mL甲苯,充分溶解。
粗酶液提取:
1. 组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL试剂一)进行冰浴匀浆。16000rpm,4℃离心40min,取上清置冰上待测。
2. 细菌、真菌:按照细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500 万细胞加入1mL试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后16000rpm,4℃,离心 40min,取上清置于冰上待测。
3. 血清: 直接检测。
LPS 测定操作:
1. 分光光度计预热30min以上,调节波长到710nm,蒸馏水调零。
2. 试剂一和试剂二置于37℃水浴预热30min以上。
3. 空白管:取5mL离心管,依次加入650μL试剂一250μL试剂二和100μL蒸馏水,置于37℃震荡反应10 min;加入1.2mL甲苯,反复震荡混匀10min,25℃,4000rpm离心10 min;
小心吸取上层溶液1mL,加入1.5mL 离心管中,再加入250μL试剂三,反复震荡5min;25℃,4000rpm 离心10 min,小心吸取上层溶液750μL,加入1mL玻璃比色皿,于710nm处测定吸光值。记为A空白管。
4. 测定管 :取5mL离心管,依次加入650μL试剂一250μL试剂二和100μL上清液,置于37℃震荡反应10 min;加入1.2mL甲苯,反复震荡混匀10min,25℃,4000rpm离心10min;小心吸取上层溶液1mL,加入1.5mL 离心管中,再加入250μL试剂三,反复震荡5min;25℃,4000rpm 离心10 min,小心吸取上层溶液750μL,加入1mL玻璃比色皿,于710nm处测定吸光值。记为A测定管。
5. 标准管:取标准品1mL,加入1.5mL离心管中,再加入250μL试剂三,反复震荡5min;25℃,4000rpm 离心10 min,小心吸取上层溶液750μL,加入1mL玻璃比色皿,于710nm处测定吸光值。记为A标准管。
LPS 活性计算:
1. 组织 LPS 活性
(1)按照蛋白浓度计算
活性单位定义:37℃中每毫克蛋白每分钟水解橄榄油生成1μmol脂肪酸为一个酶活单位。
LPS (U/mg prot) =[C 标准品×(A测定管-A空白管)÷A标准管]×V反总÷(Cpr×V样)÷T=10×[(A 测定管-A 空白管)÷A 标准管]÷Cpr
(2)按照样本质量计算
活性单位定义:37℃中每克组织每分钟水解橄榄油生成 1μmol脂肪酸为一个酶活单位。
LPS (U/g) =[C标准品×(A测定管-A空白管)÷A标准管]×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T=10×[(A 测定管-A 空白管)÷A 标准管]÷W
2. 细胞 LPS 活性
活性单位定义:37℃中每104个细胞每分钟水解橄榄油生成1μmol脂肪酸为一个酶活单位。
LPS (U/104cell) =[C标准品×(A测定管-A空白管)÷A标准管]×V反总÷(细胞数量×V样÷V 样总)÷T=10×[(A 测定管-A 空白管)÷A 标准管]÷细胞数量
3. 血清 LPS 活性
活性单位定义:37℃中每毫升血清每分钟水解橄榄油生成1μmol脂肪酸为一个酶活单位。
LPS (U/mL) = [C 标准品×(A 测定管-A 空白管)÷A 标准管]×V 反总÷V 样÷T
=10×[(A 测定管-A 空白管)÷A 标准管]
C 标准品:10 μmol/mL;V 反总:反应总体积,1mL;V 样:反应中加入样本体积,0.1mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:上清液蛋白质浓度,mg/mL,需要另外测定,建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒;W:样本质量,g;T:催化反应时间,10 min。
注意事项:
1、甲苯有毒,实验过程中需佩戴手套和口罩。
2、实验过程中须远离火源。
上海优选生物科技有限公司
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