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酰基转移酶（AAT）测试盒试剂盒

价格	￥6000.00/盒	￥5700.00/盒
起订量	≥1	≥2
所在地	上海上海	可售量 10000盒

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基本参数

品牌	优选生物/Sinobestbio	产地	上海
产品等级	优级品	产品用途	检测试剂
用途	生化检测	产品规格	50管/48样100管/96样

酰基转移酶（alcohol acyl transferase ，AAT）

活性测定试剂盒说明书

微量法

注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

AAT是一个多功能蛋白大家族，主要负责催化生物体内各种酰基化和去酰基化反应，在基因表达、代谢和信号传导中具有重要作用。

测定原理：

AAT催化乙酰CoA转移乙酰基到丁醇，释放的CoA还原DTNB生成TNB；TNB在412nm有吸收峰，测定412nm吸光度增加速率可计算AAT活性。

自备仪器和用品：

研钵、冰、台式离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅。

试剂组成和配制：

试剂一：液体 100 mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：液体 15 mL×1 瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂×1 管，-20℃保存。临用前加蒸馏水 1mL 充分溶解，4℃保存。

试剂四：液体 2 mL×1 管，4℃保存。

试剂五：粉剂×1 管，4℃避光保存。临用前加入试剂二 1mL 充分溶解，4℃避光保存。

粗酶液提取：

1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。12000g，4℃离心20min，取上清置冰上待测。

2. 细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间 3min）；然后 12000g，4℃，离心20min，取上清置于冰上待测。

3. 液体：直接检测。

AAT 测定操作：

1. 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到412nm，蒸馏水调零。

2. 试剂二在37℃水浴保温30min以上。

3. 空白管：依次在 1mL 玻璃比色皿中依次加入 20μL 蒸馏水、140μL 预热的试剂二、10μL 试剂三、20μL 试剂四和 10μL 试剂五，迅速混匀后于 412nm 比色，记录 10 s 和 130 s 的吸光值，分别记为 A1 和 A2。△A 空=A2-A1。空白管只需做 1 个。

4. 测定管：依次在 1mL 玻璃比色皿中依次加入 20μL 上清液、140μL 预热的试剂二、10μL 试剂三、20μL 试剂四和 10μL 试剂五，迅速混匀后于 412nm 比色，记录 10 s 和 130 s 的吸光值，分别记为A3 和 A4。△A 测=A4-A3。如果△A 测偏低，可以延长反应时间，如测定 10 s 和 310 s 的吸光度，相应修改计算公式中反应时间。

AAT 活性计算：

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

（1）按照蛋白浓度计算

活性单位定义：37℃中每毫克蛋白每分钟催化吸光值变化 0.001 个单为1U。

AAT (U/mg prot) = 1000×（△A 测—△A 空）÷(Cpr×V 样) ÷T

= 5000×（△A 测—△A 空）÷Cpr

（2）按照样本质量计算

活性单位定义：37℃中每克组织每分钟催化吸光值变化 0.001 个单为1U。

AAT (U/g) = 1000×（△A 测—△A 空）÷(W×V 样÷V 样总) ÷T

= 5000×（△A 测—△A 空）÷W

（3）按细胞数量计算

活性单位定义：37℃中每10⁴个细胞每分钟催化吸光值变化 0.001 个单为1U。

AAT (U/10⁴ cell) = 1000×（△A 测—△A 空）÷(细胞数量×V 样÷V 样总) ÷T

= 5000×（△A 测—△A 空）÷ 细胞数量

Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL，蛋白质浓度需要另外测定；V 样：加入反应体系中上清液体积，0.1mL；W：样本质量，g：V 样：加入反应体系中上清液体积，0.1mL；V 样总：提取液体积，1mL；T：反应时间，2 min。

b.使用 96 孔板测定的计算公式如下

（1）按照蛋白浓度计算

活性单位定义：37℃中每毫克蛋白每分钟催化吸光值变化0.001个单位为1U。

AAT (U/mg prot) = 1000×(△A 测—△A 空)×V 总÷(Cpr×V 样) ÷T

= 5000×(△A 测—△A 空)÷Cpr

（2）按照样本质量计算

活性单位定义：37℃中每克组织每分钟催化吸光值变化0.001个单位为1U。

AAT (U/g ) = 1000×(△A 测—△A 空)×V 总÷(V 样÷V 样总×W) ÷T

= 5000×(△A 测—△A 空)÷W

（3）按细胞数量计算

活性单位定义：37℃中每10⁴个细胞每分钟催化吸光值变化0.001个单位为1U。

AAT (U/10⁴ cell) = 1000×(△A 测—△A 空)÷(细胞数量×V 样÷V 样总) ÷T

= 5000×(△A 测—△A 空)÷ 细胞数量

Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL，蛋白质浓度需要另外测定；V 样：加入反应体系中上清液体积，0.02mL；V 总：反应总体积，0.2 mL；W：样品质量，g；V 样总：提取液体积，1 mL；T：反应时间，15min。Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL，蛋白质浓度需要另外测定；V 样：加入反应体系中上清液体积，0.02mL；V 总：反应总体积，0.2 mL；W：样品质量，g；V 样总：提取液体积，1 mL；T：反应时间，2min。