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游离胆固醇(free cholesterol, FC)含量测定试剂盒说明书
微量法
注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:
FC是构成细胞膜的主要成分,也是合成肾上腺皮质激素、性激素、胆汁酸及维生素D等生理活性物质的重要原料。FC浓度可作为脂代谢的指标。
测定原理:
FC氧化酶催化FC生成△4-胆甾烯酮和H2O2,过氧化物酶催化H2O2、4-氨基安替比林和酚生成红色醌类化合物,在500nm有吸收峰,其颜色深浅与FC含量成正比。
自备仪器和用品:
水浴锅、可调式移液枪、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、和蒸馏水。
试剂组成和配置:
试剂一:异丙醇 100mL(自备);
工作液:液体 20mL×1 瓶,4℃保存;
标准品:液体 1mL×1 支,浓度为 5 μ mol/mL,4℃保存。
FC 的提取:
1. 组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL试剂一)进行冰浴匀浆。8000g,4℃离心10min,取上清置冰上待测。
2. 细菌、真菌:按照细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议500万细胞加入1mL试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声2秒,间隔3秒,总时间3min);然后 8000g,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。
3.血清(浆)样品:直接测定。
测定操作:
1. 分光光度计/酶标仪预热30min,调节波长到500nm,蒸馏水调零。
2. FC工作液在40℃水浴中预热 30min。
3. 标准管:依次在微量石英比色皿/96孔板中加入4μL FC标准液和196μL FC工作液,5min
后于500nm测定A标准管。
4. 测定管:依次在微量石英比色皿/96孔板中加入4μL FC待测液和 196μL FC 工作液,5min后于500nm测定A测定管。
计算公式:
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1. 血清(浆)中 FC含量计算:
FC 含量(μmol /dL)= C 标准液×A 测定管÷A 标准管×100mL
=500×A 测定管÷A 标准管
C 标准液:5μmol/mL;100 mL:1dL=100 mL。
2. 组织中 FC含量计算:
(1)按样本蛋白浓度计算
FC 含量(μmol/mg prot)= C 标准液×A 测定管÷A 标准管÷Cpr
= 5×A 测定管÷A 标准管÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
FC 含量(μmol/g)= C 标准液×A 测定管÷A 标准管÷W
= 5×A 测定管÷A 标准管÷W
C 标准液:5μmol/mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W:样本质量,g/mL
3. 细胞、细菌中FC含量计算:
FC 含量(μmol/104cell)= C 标准液×A 测定管÷A 标准管÷细菌或细胞(104cell/L)
=5×A 测定管÷A 标准管÷细菌或细胞(104cell/L)
C 标准液:5μmol/mL。
b.使用96孔板测定的计算公式如下
1. 血清(浆)中FC含量计算:
FC 含量(μmol /dL)= C 标准液×A 测定管÷A 标准管×100mL
=500×A 测定管÷A 标准管
C 标准液:5μmol/mL;100 mL:1dL=100 mL。
2. 组织中 FC 含量计算:
(1)按样本蛋白浓度计算
FC 含量(μmol/mg prot)= C 标准液×A 测定管÷A 标准管÷Cpr
= 5×A 测定管÷A 标准管÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
FC 含量(μmol/g)= C 标准液×A 测定管÷A 标准管÷W
= 5×A 测定管÷A 标准管÷W
C 标准液:5μmol/mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W:样本质量,g/mL
3. 细胞、细菌中FC含量计算:
FC 含量(μmol /104cell)= C 标准液×A 测定管÷A 标准管÷细菌或细胞(104cell/L)
=5×A 测定管÷A 标准管÷细菌或细胞(104cell/L)
C 标准液:5μmol/mL。
注意事项:
最低检出限为1mmol/L。
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伍雅君
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