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上海优选生物科技有限公司
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乙酰辅酶A 羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase，ACC)试剂盒说明书
分光光度法
产品内容：
提取液：60mL×1 瓶，4℃保存；
试剂一：20mL×1 瓶，4℃保存；
试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存；
试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃保存；
试剂四：粉剂×1 瓶, 4℃保存。用时加入25mL 蒸馏水，溶解后4℃可保存一周。
试剂五：粉剂×1 瓶, 4℃保存。用时加入25mL 蒸馏水，溶解后4℃可保存一周。
试剂六：液体 25mL×1 瓶，室温保存。
试剂七：10μmol/mL 标准磷贮备液 10mL×1 瓶，4℃保存。
产品说明：
ACC在生物体内催化乙酰辅酶A羧化生成丙二酰辅酶A，是脂肪酸和许多次生代谢产物合成的关键酶。ACC的活性在一定程度上决定了脂肪酸的合成速度和含油量的高低。
ACC 能够催化乙酰辅酶A、NaHCO3 和ATP 生成丙二酰辅酶A、ATP 和无机磷，通过钼酸铵定磷法测定无机磷的增加量来测定ACC 活性。
需自备的仪器和用品：
分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本的前处理
1、 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为500~1000：1 的比例（建议500 万细菌或细胞加入1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30 次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10 的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
二、测定步骤
1、 分光光度计预热30min 以上，调节波长至660nm，蒸馏水调零。
2、 酶促反应试剂的配制和预热：在试剂二瓶中加入6.5mL 试剂一，充分溶解混匀；在试剂三瓶中加入5mL 蒸馏水，充分溶解混匀；将试剂一、二、三在37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热10 分钟。
3、 定磷试剂的配制：按H2O: 试剂四:试剂五:试剂六=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷试剂应为浅黄色，若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂现用现配。
注意：配试剂最好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。
4、0.5μmol/mL 标准磷应用液配制：将试剂七20倍稀释，即取0.5mL试剂七加9.5 蒸馏水，充分混匀。
5、酶促反应
试剂名称（μL） |
对照管 |
测定管 |
试剂一 |
450 |
|
试剂二 |
250 |
|
试剂三 |
200 |
|
样本 |
50 |
50 |
37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）准确反应30min 后，90℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失），冷却后，10000g 常温离心5min，取上清
6、定磷
标准管 |
空白管 |
对照管 |
测定管 |
|
0.5μmol/mL 标准磷应用液 |
100 |
|||
蒸馏水 |
100 |
|||
上清液 |
100 |
100 |
||
定磷试剂 |
900 |
900 |
900 |
900 |
混匀，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴30min，冷却至室温，在660nm处，蒸馏水调零，记录各管吸光值A。标准管、空白管只要做一次即可，每个测定管需要设一个对照管。
注意：若测定管吸光值大于2，将样品用提取液稀释适当倍数后再进行测定，使吸光值小于2，可提高检测灵敏度，计算公式中乘以相应稀释倍数。
三、ACC 活性计算：
1、 按组织蛋白浓度计算：
定义：每小时每毫克组织蛋白产生1μmol 无机磷的量为一个 ACC 活力单位。
ACC (U/mg prot)=(C 标准管×V 总)×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷(V 样×Cpr)÷T=10×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷Cpr
2、 按样本鲜重计算：
定义：每小时每g 组织产生1μmol无机磷的量为一个ACC活力单位。
ACC (U/g 鲜重)=(C 标准管×V 总)×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管）×V 总÷(W× V 样÷V 样总)÷T=10×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷W
3、 按细菌或细胞密度计算：
定义：每小时每500万细菌或细胞产生1μmol 无机磷的量为一个ACC活力单位。
ACC (U/104cell)=(C 标准管×V 总)×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管）×V 总
÷(500× V 样÷V 样总)÷T=0.02×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)
C 标准管：标准管浓度，0.5μmol/mL；V 总：酶促反应总体积，0.5mL；V 样：加入样本体积，0.05mL ；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，0.5 小时；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g；500：细菌或细胞总数，500 万。
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