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可溶性酸性转化酶(Soluble acid invertase, S-AI)试剂盒说明书
微量法
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
蔗糖转化酶(Invertase,Ivr)催化蔗糖不可逆地分解为果糖和葡萄糖,是高等植物蔗糖
代谢关键酶之一。根据最适pH,Ivr 分为酸性转化酶(AI)和中性转化酶(NI)两种类型。AI 的最适pH为 3~5。AI分为可溶性AI(S-AI)和细胞壁不溶性AI(B-AI)两种类型。S-AI主要存在于细胞液泡或自由空间中,最适pH为4.5~5.0(酸性),通过降解液泡中蔗糖,调节液泡中蔗糖的利用和果实内糖类的积累。
测定原理:
S-AI催化蔗糖降解产生还原糖,进一步与 3,5-二硝基水杨酸反应,生成棕红色氨基化合物,在510nm有特征光吸收,在一定范围内510nm光吸收增加速率与S-AI活性成正比。
自备用品:
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制:
提取液:液体 100mL×1 瓶,4℃保存;
试剂一:液体 20mL×1 瓶,4℃保存;
试剂二:粉剂×1 瓶,4℃保存;临用前加入10mL试剂一充分溶解备用;用不完的试剂 4℃
保存;
试剂三:液体 15mL×1 瓶,4℃保存;
粗酶液提取:
按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。12000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
测定步骤和加样表:
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至510nm,蒸馏水调零。
2、样本测定(在EP管中依次加入下列试剂):
试剂名称(μL) |
测定管 |
对照管 |
样本 |
50 |
50 |
试剂一 |
200 |
|
试剂二 |
200 |
|
混匀, 37℃准确水浴 30min 后,95℃水浴 10min(盖紧,以防水分散失),流水冷却后充分 混匀(以保证浓度不变) |
||
试剂三 |
125 |
125 |
混匀,95℃水浴10min(盖紧,以防止水分散失),流水冷却后充分混匀,取200μL至微量石英比色皿或96孔板中, 510nm处记录各管吸光值A,如果吸光值大于2,可以用蒸馏水稀释后测定(计算公式中乘以相应稀释倍数),ΔA=A测定-A对照。每个测定管需设一个对照管。
S-AI 活性计算:
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准条件下测定的回归方程为y =0.0016x-0.001;x为标准品浓度(μg/mL),y为吸光值。
(1)按蛋白浓度计算:
单位的定义:37℃每mg蛋白每分钟产生1μg还原糖定义为一个酶活性单位。
S-AI 活性(μg/min/mg prot)=[(ΔA +0.001) ÷0.0016×V1]÷(V1×Cpr ) ÷T
=20.8×(ΔA +0.001)÷Cpr
(2)按鲜重计算:
单位的定义:37℃每g组织每分钟产生1μg还原糖定义为一个酶活性单位。
S-AI 活性(μg/min/g 鲜重)=[(ΔA +0.001) ÷0.0016×V1]÷(W×V1÷V2) ÷T
=20.8×(ΔA +0.001)÷W
V1:加入反应体系中样本体积,0.05mL;V2:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,30min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本鲜重,g。
b.用96孔板测定的计算公式如下
标准条件下测定的回归方程为y =0.0008x-0.001;x为标准品浓度(μg/mL),y为吸光值。
(1)按蛋白浓度计算:
单位的定义:37℃每mg蛋白每分钟产生1μg还原糖定义为一个酶活性单位。
S-AI 活性(μg/min/mg prot)=[(ΔA +0.001) ÷0.0008×V1]÷(V1×Cpr ) ÷T
=41.6×(ΔA +0.001)÷Cpr
(2)按鲜重计算:
单位的定义:37℃每g组织每分钟产生1μg还原糖定义为一个酶活性单位。
S-AI 活性(μg/min/g 鲜重)=[(ΔA +0.001) ÷0.0008×V1]÷(W ×V1÷V2)
=41.6×(ΔA +0.001) ÷W
V1:加入反应体系中样本体积,0.05mL;V2:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,30min;
Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本鲜重,g。
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