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中性转化酶(Neutral invertase,NI)测试盒说明书
可见分光光度法
产品内容:
提取液:液体50mL×1瓶,4℃保存;
试剂一:液体50mL×1瓶,-20℃保存;
试剂二:粉剂×1瓶,4℃保存;临用前加入25mL试剂一充分溶解备用;用不完的试剂4℃保存。
试剂三:液体30mL×1瓶,4℃保存。
产品简介:
蔗糖转化酶(Invertase,Ivr)催化蔗糖不可逆地分解为果糖和葡萄糖,是高等植物蔗糖代谢关键酶之一。根据最适 pH,将高等植物Ivr分为酸性转化酶(AI)和中性转化酶(NI)两种类型。NI主要存在于细胞质中,负责分解细胞质中蔗糖为果糖和葡萄糖。
NI催化蔗糖分解产生还原糖,进一步与3,5-二硝基水杨酸反应,生成棕红色氨基化合物,在510nm有特征光吸收,在一定范围内510nm光吸收值与还原糖生成量成正比。通过光吸收增加速率来计算NI活性。
试验中所需的仪器和试剂:
可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL玻璃比色皿、研钵、冰、蒸馏水。
操作步骤:
一、粗酶液提取:
按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。12000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
二、测定步骤及加样表:
按下表操作:
试剂名称(μL) |
测定管 |
标准管 |
样本 |
200 |
200 |
试剂一 |
/ |
800 |
试剂二 |
800 |
/ |
混匀,37℃准确水浴30min后,煮沸10min左右(盖紧,以防止水分散失),流水冷却后充分混匀(以保证浓度不变) |
||
试剂三 |
500 |
500 |
混匀,煮沸10min左右(盖紧,以防止水分流失),流水冷却后充分混匀,510nm处蒸馏水调零,记录各管吸光值A,如果吸光值大于2,可以用蒸馏水稀释后测定(计算公式中乘以相应稀释倍数),ΔA=A测定-A对照。
三、N I 活性计算:
标准条件下测定的回归方程为y=0.0016x-0.001;x为标准品浓度(μg/mL),y为吸光值。
1、 按蛋白浓度计算
单位定义:37℃每mg蛋白每分钟产生1μg还原糖定义为一个酶活性单位。
NI活性(U/mg prot)=[(ΔA+0.001)÷0.0016×V1]÷(V1×Cpr)÷T
=20.8×(ΔA+0.001) ÷Cpr
2、 按鲜重计算
单位定义:37℃每g组织每分钟产生1μg还原糖定义为一个酶活性单位。
NI活性(U/g)=[(ΔA+0.001)÷0.0016×V1]÷(W×V1÷V2)÷T=20.8×(ΔA+0.001) ÷W
V1:加入反应体系中样本体积,0.2mL;V2:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本鲜重,g;T:反应时间:30min。
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