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上海优选生物科技有限公司
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还原糖含量试剂盒说明书
微量法
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
还原糖广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中。植物体内的还原糖主要包括葡萄糖、
果糖和麦芽糖等，是最常见的单糖和双糖，其中葡萄糖和果糖不仅是呼吸作用的主要底物，也是进一步合成蔗糖、淀粉和纤维素的底物。
测定原理：
加热促进碱性溶液中 3,5-二硝基水杨酸溶液与还原糖生成棕红色氨基化合物，在 540nm 有特征吸收峰；在一定的浓度范围内，还原糖含量与 540nm 吸光度成线性关系，根据标准曲线，即可求出样品中还原糖的量。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、蒸馏水。
试剂的组成和配制：
试剂一：100mL×1 瓶，4℃保存；
试剂二：15mL×1 瓶 ，4℃保存；
样品中还原糖的提取：
1、细菌或细胞的处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL试剂一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3S，间隔10S，重复30次），转移到有盖离心管中（防止加热时水分散失），80℃水浴中40min 并且振荡8~10次，8000g，25℃离心10min，取上清供测定用。
2、组织的处理：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一），冰浴匀浆，转移到有盖离心管中（防止加热时水分散失），80℃水浴中40min 并且振荡8~10次，8000g，25℃离心10min，取上清供测定用。
3、血清（浆）的处理：按照血清（浆）体积（mL）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议取0.1mL血清（浆）加入1mL试剂一），冰浴匀浆，转移到有盖离心管中（防止加热时水分散失），80℃水浴中40min 并且振荡8~10次，8000g，25℃离心10min，取上清供测定用。
测定步骤：
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。
2、调节水浴锅至95℃。
3、在EP管中加入下列试剂：
试剂（μL） |
对照管 |
测定管 |
样本 |
175 |
175 |
试剂二 |
125 |
|
蒸馏水 |
125 |
混匀，在95℃水浴中加热5min（盖紧，防止水分散失），取出后立即冷却至室温，混匀。取
200μL至微量石英比色皿或96孔板中，540nm 波长下读取对照管和测定管吸光值。计算ΔA=A 测定-A 对照。
注意：1、每个测定管需设一个对照管。
2、如果ΔA大于2，需要将样本用试剂一稀释，计算公式中乘以相应稀释倍数。
还原糖含量计算：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、标准条件下测定回归方程为y=8.5067x-2.0807；x为标准品浓度（mg/mL），y为吸光值。
2、按样本鲜重计算：
还原糖(μg/g 鲜重)=[1000×(ΔA＋2.0807)÷8.5067×V1]÷(W×V1÷V2)
=117.55×(ΔA＋2.0807)÷W
3、按样本蛋白浓度计算：
还原糖(μg/mg prot)=[1000×(ΔA＋2.0807) ÷8.5067×V1]÷(V1×Cpr)
=117.55×(ΔA＋2.0807)÷Cpr
4、按细菌或细胞密度计算：
还原糖(μg /104cell)=[1000×(ΔA＋2.0807) ÷8.5067×V1]÷（500×V1÷V2）
=0.235×(ΔA＋2.0807)
5、按血清（浆）体积计算：
还原糖(μg/mL)=[1000×(ΔA＋2.0807) ÷8.5067×V1]÷（V3×V1÷V2）
=1175.5×(ΔA＋2.0807)
1000：1mg/mL=1000μg/mL；V1：加入样本体积，0.175mL；V2：加入试剂一体积，1 mL；V3：加入血清（浆体积），0.1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。
b.用96孔板测定的计算公式如下
1、标准条件下测定回归方程为y=4.2534x -2.0807；x为标准品浓度（mg/mL），y为吸光值。
2、按样本鲜重计算：
还原糖（μg/g 鲜重）＝[1000×(ΔA＋2.0807)÷4.2534×V1]÷(W×V1÷V2)
=235.1×(ΔA＋2.0807)÷W
3、按样本蛋白浓度计算：
还原糖（μg/mg prot）= [1000×(ΔA＋2.0807) ÷4.2534×V1]÷(V1×Cpr)
=235.1×(ΔA＋2.0807)÷Cpr
4、按细菌或细胞密度计算：
还原糖（μg/104cell）= [1000×(ΔA＋2.0807) ÷4.2534×V1]÷（500×V1÷V2）
=0.47×(ΔA＋2.0807)
5、按血清（浆）体积计算：
还原糖（μg/mL）＝[1000×(ΔA＋2.0807) ÷4.2534×V1]÷（V3×V1÷V2）
=2351×(ΔA＋2.0807)
1000：1mg/mL=1000μg/mL；V1：加入样本体积，0.175mL；V2：加入试剂一体积，1 mL；V3：加入血清（浆体积），0.1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。
注意：最低检测限为1mg/g 鲜重或 10μg/mg prot
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