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上海优选生物科技有限公司
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纤维素酶（cellulase，CL）活性测定试剂盒说明书
微量法
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
CL（EC3.2.1.4） 存在于细菌、真菌和动物体内，能够催化纤维素降解，是一类可广泛应用于医药、食品、棉纺、环保及可再生资源利用等领域的酶制剂。
测定原理：
采用3,5－二硝基水杨酸法测定CL催化纤维素降解产生的还原糖的含量。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存；
试剂一：液体 5mL×1 瓶，4℃保存；
试剂二：液体 20mL×1 瓶，4℃保存；
试剂三：液体 5mL×1 瓶，4℃保存；
样品测定的准备：
1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
测定步骤：
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至550nm，蒸馏水调零。
2、加样表（在EP管中依次加入下列试剂）：
试剂名称（μL） |
对照管 |
测定管 |
试剂一 |
50 |
50 |
试剂二 |
200 |
200 |
蒸馏水 |
50 |
50 |
样本 |
50 |
|
煮沸的样本 |
50 |
|
混匀，40℃准确水浴 30min 后沸水浴 15min,（盖紧，防止水分散失），得糖化液 |
||
糖化液 |
15 |
15 |
试剂三 |
35 |
35 |
混匀， 沸水浴显色 15min（盖紧，防止水分散失），冷却 |
||
蒸馏水 |
250 |
250 |
混匀，冷却后，取 200μL 至微量石英比色皿或 96 孔板中，测 550nm 下吸光值 A，计算
ΔA=A 测定管-A 对照管。每个测定管需设一个对照管。
CL活性计算
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、标准条件下测定回归方程为y=0.3356x - 0.012；x为标准品浓度（mg/mL），y为吸光值。
2、按照蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1μg葡萄糖定义为一个酶活力单位。
CL 活力(μg /min/mg prot)=[1000×(ΔA+0.012) ÷0.3356×V 反总]÷(V 样×Cpr) ÷T
=695×(ΔA+0.012) ÷Cpr
3、按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织每分钟催化产生1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。
CL 活力(μg/min/g 鲜重)=[1000×(ΔA+0.012)÷0.3356×V反总]÷(W×V样÷V样总) ÷T=695×(ΔA+0.012) ÷W
4、按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1μg葡萄糖定义为一个酶活力单位。
CL 活力(μg/min/104cell)=[1000×(ΔA+0.012) ÷0.3356×V反总]÷(500×V样÷V样总) ÷T=1.39×(ΔA+0.012)
1000：1mg/mL=1000ug/mL；V 反总：反应体系总体积，0.35mL； V 样：加入样本体积，0.05 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。
b.用96孔板测定的计算公式如下
1、标准条件下测定回归方程为y=0.1678x - 0.012；x 为标准品浓度（mg/mL），y 为吸光值。
2、按照蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1μg葡萄糖定义为一个酶活力单位。
CL 活力(μg/min/mg prot)=[1000×(ΔA+0.012)÷0.1678×V 反总]÷(V 样×Cpr)÷T
=1390×(ΔA+0.012) ÷Cpr
3、按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织每分钟催化产生1μg葡萄糖定义为一个酶活力单位。
CL 活力(μg/min/g 鲜重)=[1000×(ΔA+0.012)÷0.1678×V反总]÷(W× V样÷V样总)÷T=1390×(ΔA+0.012)÷W
4、按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1μg葡萄糖定义为一个酶活力单位。
CL 活力(μg/min/104cell)=[1000×(ΔA+0.012)÷0.1678×V反总]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=2.78×(ΔA+0.012)
1000：1mg/mL=1000ug/mL；V 反总：反应体系总体积，0.35mL； V 样：加入样本体积，0.05 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。
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