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上海优选生物科技有限公司
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β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase, β-GC)试剂盒说明书
微量法
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
β-GC(EC 3.2.1.21)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,催化β-糖苷键水解,具有多方面生理作用:在纤维素的糖化作用中,β-GC负责进一步水解纤维素二糖和纤维素寡糖生成葡萄糖;β-GC水解萜烯类香气前驱体,使糖苷键合态变成游离态。从而产生香味;
β-GC能够水解植物体内野黑樱苷,释放 HCN,从而防止昆虫取食。
测定原理:
β-GC分解对-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷生成对-硝基苯酚,后者在400nm有最大吸收峰,通过测定吸光值升高速率来计算β-GC活性。
自备用品:
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水
试剂组成和配制:
提取液:液体 100mL×1 瓶,4℃保存。
试剂一:粉剂×1 瓶,-20℃保存;临用前每瓶加入12mL蒸馏水,充分溶解备用;用不完的试剂仍-20℃保存。
试剂二:液体 15mL×1 瓶,4℃保存。
试剂三:液体 15mL×1 瓶,4℃保存。
粗酶液提取:
1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);15000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
测定步骤
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至400nm,蒸馏水调零。
2、加样表
试剂名称(μL) |
测定管 |
对照管 |
试剂一 |
120 |
|
试剂二 |
150 |
150 |
样本 |
30 |
30 |
充分混匀,放入 37℃准确水浴 30min 后,立即放入 95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失),流水冷却后充分混匀(以保证浓度不变) |
||
试剂一 |
120 |
|
充分混匀,8000g,4℃,离心 5min,取上清液(在 EP 管或 96 孔板中加入下列试剂) |
||
上清液 |
70 |
70 |
试剂三 |
130 |
130 |
充分混匀,室温静置2min后,400nm 处测定吸光值A,计算 ΔA=A测定管-A对照管。
每个测定管需设一个对照管。
β-GC 活力计算:
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准条件下测定的回归方程为y=0.32x-0.0027;x为标准品浓度(nmol/mL),y为吸光值。
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
β-GC 活力(nmol/h/mg prot)=[(ΔA+0.0027) ÷0.32×V 反总]÷(V 样×Cpr)÷T
=62.5×(ΔA+0.0027)÷Cpr
需要另外测定,建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。
(2)按样本鲜重计算:
单位的定义:每g组织每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
β-GC 活力(nmol/h/g 鲜重)=[(ΔA+0.0027)÷0.32×V反总]÷(W×V样÷V样总)÷T
=62.5×(ΔA+0.0027) ÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每1万个细菌或细胞每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
β-GC 活力(nmol/h/104cell)=[(ΔA+0.0027) ÷0.32×V反总]÷(500×V样÷V样总)÷T
=0.125×(ΔA +0.0027)
Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;V 反总:反应体系总体积,0.3mL;V 样:加入反应体系中样本体积,0.03mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;W:样本质量,g; 500:细胞或细菌总数,500 万;T:反应时间,0.5h。
b.用96孔板测定的计算公式如下
标准条件下测定的回归方程为y=0.16x-0.0027;x为标准品浓度(nmol/mL),y为吸光值。
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
β-GC 活力(nmol/h/mg prot)=[(ΔA+0.0027)÷0.16×V 反总]÷(V 样×Cpr)÷T
=125×(ΔA+0.0027)÷Cpr
需要另外测定,建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。
(2)按样本鲜重计算:
单位的定义:每g组织每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
β-GC 活力(nmol/h/g 鲜重)=[(ΔA+0.0027)÷0.16×V 反总]÷(W×V 样÷V 样总)÷T
=125×(ΔA+0.0027) ÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每1万个细菌或细胞每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
β-GC 活力(nmol/h/104cell)=[(ΔA+0.0027) ÷0.16×V反总]÷(500×V样÷V样总)÷T
=0.25×(ΔA +0.0027)
Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;V 反总:反应体系总体积,0.3mL;V 样:加入反应体系中样本体积,0.03mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;W:样本质量,g; 500:细胞或细菌总数,500 万;T:反应时间,0.5h。
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