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中性木聚糖酶(Neutral Xylanase,NEX)测定试剂盒说明书
微量法
注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:
木聚糖酶(EC 3.2.1.8)主要由微生物产生,能催化水解木聚糖,也被称为戊聚糖酶或半纤维素酶,可分解酿造或饲料工业中的原料细胞壁以及 β-葡聚糖,降低酿造中物料的粘度,促进有效物质的释放,以及降低饲料中的非淀粉多糖,促进营养物质的吸收利用,因而广泛的应
用于酿造和饲料工业中,NEX 一般分离自最适生长pH为6-8的微生物。
测定原理:
NEX 在中性环境中催化木聚糖降解成还原性寡糖和单糖,在沸水浴条件下进一步与 3,5-二硝基水杨酸发生显色反应,在 540nm 处有特征吸收峰,反应液颜色的深浅与酶解产生的还
原糖量成正比,通过测定反应液在 540nm 吸光值增加速率,可计算 NEX 活力。
自备实验用品及仪器:
天平、低温离心机、恒温水浴锅,可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板和蒸馏水。
试剂组成和配制:
缓冲液:液体 65mL×1 瓶,4℃保存。
试剂一:液体 10mL×1 瓶,4℃避光保存。
试剂二:液体 10mL×1 瓶,4℃避光保存。
粗酶提取:
1. 发酵液:发酵液于 8000g,4℃,离心 15min,取上清,作为待测样品。
2. 酶干粉:称约 0.1mg,加缓冲液 1mL,震荡溶解待测。
测定操作表:
1、分光光度计/酶标仪预热30min,调节波长至540nm。
2、操作表
对照管 |
测定管 |
|
样品(μL) |
60 |
60 |
缓冲液(μL) |
90 |
90 |
试剂一(μL) |
60 |
|
试剂二(μL) |
90 |
|
混匀,盖紧瓶盖,50℃水浴,反应 30min,立即沸水浴 10min 灭活。(注意不要让盖子爆开, 以免进水,改变了反应体系) |
||
试剂一(μL) |
60 |
|
试剂二(μL) |
90 |
|
混匀,沸水浴显色 5min,取 200μL 于微量石英比色皿/96 孔板中,对照管调零,测定 A 540 。 |
NEX 计算公式:
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准曲线:y=1.6904x+0.0058,R2=0.9989
1. 发酵液NEX活力计算
酶活定义:50℃,pH6.0条件下,每毫升发酵液每分钟分解木聚糖产生1nmol还原糖所需的酶量为一个中性木聚糖酶的活力单位。
NEX 活力(nmol/min/mL)=(A540-0.0058)÷1.6904÷150÷T×稀释倍数×1000
= 657×(A540-0.0058 )
2. 酶干粉 NEX 活力计算
酶活定义:50℃,pH6.0条件下,每毫克酶每分钟分解木聚糖产生1nmol还原糖所需的酶量为一个中性木聚糖酶的活力单位。
NEX 活力(nmol/min/mg)=(A540-0.0058)÷1.6904÷150÷T×稀释倍数×1000÷W
= 657×(A540-0.0058 ) ÷W
150:木糖的分子量;T:反应时间,30min;稀释倍数=V 反总÷V 样=300μL÷60μL=5;1000:
转化因子,即 1mmol/L=1000μ mol/L;W:样本质量,mg
b.用96孔板测定的计算公式如下
标准曲线:y=0.8452x+0.0058,R2=0.9989
1. 发酵液 NEX 活力计算
酶活定义:50℃,pH6.0条件下,每毫升发酵液每分钟分解木聚糖产生1nmol还原糖所需的酶量为一个中性木聚糖酶的活力单位。
NEX 活力(nmol/min/mL)=(A540-0.0058)÷0.8452÷150÷T×稀释倍数×1000
= 1314×(A540-0.0058 )
2. 酶干粉 NEX 活力计算
酶活定义:50℃,pH6.0条件下,每毫克酶每分钟分解木聚糖产生1nmol还原糖所需的酶量为一个中性木聚糖酶的活力单位。
NEX 活力(nmol/min/mg)=(A540-0.0058)÷0.8452÷150÷T×稀释倍数×1000÷W
= 1314×(A540-0.0058 ) ÷W
150:木糖的分子量;T:反应时间,30min;稀释倍数=V 反总÷V 样=300μL÷60μL=5;1000:转化因子,即 1mmol/L=1000μ mol/L;W:样本质量,mg
注意事项:
1. 吸光度变化应该控制在0.01~0.8之间,否则加大样品量或稀释样品,注意计算公式中参与计算的稀释倍数要相应改变;也可以延长或者缩短反应时间。
2. 试剂盒2-8℃保存,保质期3个月,建议尽快使用。
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