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红霉素-N-脱甲基酶（ERND）测试盒试剂盒

价格	￥1400.00/盒	￥1300.00/盒
起订量	≥1	≥2
所在地	上海上海	可售量 10000盒

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基本参数

品牌	优选生物/Sinobestbio	产地	上海
产品等级	优级品	产品用途	检测试剂
用途	生化检测	产品规格	50管/24样100管/48样

红霉素-N-脱甲基酶（Erythromycin N-demethylase，ERND）

试剂盒说明书

可见分光光度法

注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

细胞色素 P450 酶是一组主要存在于肝脏的酶系，在外源物质代谢中，尤其是药物和毒物的代谢，具有重要作用。ERND 在 P450 酶系中相当于 CYP2B 亚型，与药物代谢的去甲基化密切相关。CYP2B 具有催化底物形成非活性易于排泄的代谢产物而具有解毒作用，也可使某些药物经 CYP2B 代谢活化。

测定原理：

ERND 催化红霉素释放甲醛，通过 Nash 比色测定甲醛含量，即可计算出 ERND 活性。

自备仪器和用品：

可见分光光度计、普通离心机，超速离心机、可调式移液枪、1mL 玻璃比色皿、蒸馏水和冰。

试剂组成和配制：

试剂一：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加50mL蒸馏水溶解。

试剂二：液体×1 瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加2.6mL蒸馏水，充分溶解。

试剂四：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加2.6mL蒸馏水，充分溶解。

试剂五：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前，加蒸馏水9mL充分溶解。

试剂六：液体×1 瓶，4℃保存。

试剂七：液体×1 瓶，4℃保存。

标准液：液体×1 瓶，-20℃保存。临用前取1.5 mL EP管，加入10μl标准液，加990μl蒸馏水，混匀即为0.05 mmol/L标准甲醛溶液，4℃保存。

粗酶液提取：

1、除去细胞核，线粒体等大分子物质：称约0.5g组织，加入1mL试剂一，冰上充分研磨，10000g 4℃离心 30min，取上清液，转入超速离心管中。

2、粗制微粒体：100 000g，4℃，离心60min，弃上清液。

3、除血红蛋白等杂质：向步骤2的沉淀中加1mL试剂一，盖紧后充分震荡溶解，100 000g离心30min，弃上清液。

4、最终微粒体：向步骤3的沉淀中加试剂二0.5mL，充分震荡溶解，即粗酶液，待测。该待测液需当天使用。

测定操作：

1. 分光光度计预热30min以上，调节波长到412nm，蒸馏水调零。

2. 试剂二置于37℃水浴中预热30 min。

3. 对照管：取 1支 EP 管，加入50μL粗酶液，850μL试剂二，50μL试剂三，50μL 蒸馏水，混匀后置于 37℃水浴保温 30min；立即加入 175μL 试剂五，混匀后置于冰浴中 5min；取出后加入 175μL 试剂六，混匀后室温静置 5min；室温 8000rpm 离心 5min；取新的 EP 管，加入500μL上清液，500μL试剂七，混匀后60 ℃水浴10min，然后取出，用冷水冷却5min，于412nm 测定光吸收，记为A对照管。

4. 测定管：取1支EP管，加入50μL粗酶液，850μL试剂二，50μL试剂三，50μL 试剂四，混匀后置于37℃水浴保温 30min；立即加入175μL试剂五，混匀后置于冰浴中5min；取出后加入175μL试剂六，混匀后室温静置 5min；室温 8000rpm 离心 5min；取1支新 EP管，加入500μL上清液，500μL试剂七，混匀后60 ℃水浴 10min，然后取出，用冷水冷却5min，于412nm 测定光吸收，记为A测定管。

5. 标准管：取1支EP管，加入500μL标准品，500μL试剂七，混匀后60 ℃水浴 10min，然后取出，用冷水冷却 5min，于 412nm 测定光吸收，记为 A 标准管。

注意：每个样品都需要做对照管。

ERND 活性计算公式：

(1) 按照蛋白浓度计算:

活性单位定义：37℃下，每分钟每毫克蛋白催化产生1nmol甲醛为1个酶活单位。

ERND 活性(nmol/min/mg prot) = C 标准品×V 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管×稀释倍数÷（Cpr×V 样）÷T= 45×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管÷Cpr。

(2). 按照样本质量计算:

活性单位定义：37℃下，每分钟每克样品催化产生 1nmol 甲醛为 1 个酶活单位。

ERND 活性(nmol/min/g) = C 标准品×V 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管×稀释倍数÷（W×V 样）÷T= 45×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管÷W

C 标准品：0.05 mmol/L=50μmol/L；V 标准品：500μL=0.0005 L；稀释倍数：V 反总÷V 上清液=（50+850 +50+50+175+175）÷500=2.7；Cpr：粗酶液蛋白质浓度，mg/mL，需要另外测

定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒；V 样：加入粗酶液体积，50μL=0.05mL；

W：样本质量，g；T：催化反应时间，30min。