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土壤α-葡萄糖苷酶(Solid-α-Glucosidase,S-α-GC)
试剂盒说明书
微量法
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
S-α-GC能够催化水解芳基或烃基与糖基原子团之间的糖苷键生成葡萄糖,是纤维素分解酶系中重要组成成分之一,在土壤微生物的糖类代谢方面具有重要生理功能。
测定原理:
S-α-GC能够催化对-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷生成对-硝基苯酚,后者在400nm有特征光吸收。
自备用品:
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰、甲苯(不允许快递)和蒸馏水。
试剂组成和配制:
试剂一:甲苯 5mL×1 瓶,4℃保存;(自备)
试剂二:粉剂×1 瓶,-20℃保存;临用前每瓶加入13mL蒸馏水,充分溶解备用,用不完的试剂仍-20℃保存;
试剂三:液体 20mL×1 瓶,4℃保存;
试剂四:液体 15mL×1 瓶,4℃保存;
测定步骤:
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至400nm,蒸馏水调零。
2、加样表
试剂名称 |
测定管 |
对照管 |
风干土样(g) |
0.02 |
0.02 |
试剂一(μL) |
10 |
10 |
振荡混匀,使土样全部湿润,室温放置 15min |
||
试剂二(μL) |
130 |
|
试剂三(μL) |
160 |
160 |
混匀, 37℃水浴 1h 后,95℃水浴 5min(盖紧,防止水分散失),流水冷却 |
||
试剂二(μL) |
130 |
|
充分混匀,10000g 25℃离心 10min,取上清液(在 EP 管或 96 孔板中加入下列试剂) |
||
上清液(μL) |
70 |
70 |
试剂四(μL) |
130 |
130 |
充分混匀,室温静置2min 后,400nm处测定吸光值A,计算 ΔA=A测定管-A对照管。每个测定管设一个对照管。
S-α-GC 活力计算:
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准条件下测定的回归方程为y=0.0032x-0.0027;x为标准品浓度(μmol/L),y为吸光值。
单位的定义:每天每g土样中产生1μmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
S-α-GC 活力(μmol/d/g 土样)= (ΔA+0.0027) ÷0.0032×V 反总÷W÷T
=112.5×(ΔA+0.0027)
T:反应时间,1h=1/24d; V 反总:反应体系总体积:3×10 -4 L;W:样本质量,0.02g。
b.用96孔板测定的计算公式如下
标准条件下测定的回归方程为y=0.0016x-0.0027;x为标准品浓度(μmol/L),y为吸光值。
单位的定义:每天每g土样中产生1μmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
S-α-GC 活力(μmol/d/g 土样)= (ΔA+0.0027) ÷0.0016×V 反总÷W÷T
=225×(ΔA+0.0027)
T:反应时间,1h=1/24d; V 反总:反应体系总体积:3×10 -4 L;W:样本质量,0.02g。
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