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H2S含量测定试剂盒说明书
微量法
注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:
H2S是一种新型气态信号分子,存在于脑内的神经递质,生理浓度的 H2S对神经系统海马的长时程增强功能具有重要的调节作用,并对自发性高血压、出血性休克及肝硬化等疾病的过程发挥着重要的病理生理效应。
测定原理:
H2S与醋酸锌、N, N-二甲基对苯二胺和硫酸铁铵等反应生成亚甲基蓝,亚甲基蓝在665nm处有最大吸收峰,通过测定其吸光值可计算 H2S含量。
自备实验用品及仪器:
天平、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、蒸馏水。
试剂组成和配制:
提取液:液体 100mL×1 瓶,4℃保存。
试剂一:液体 15mL×1 瓶,4℃保存。
试剂二:液体 8mL×1 瓶,4℃保存。
试剂三:液体 8mL×1 瓶,4℃避光保存。
试剂四:液体 8mL×1 瓶,4℃保存。
试剂五:液体 1.5mL×1 管,4℃避光保存。
样品处理:
1. 组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液)进行冰浴匀浆,然后10000g,4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2. 细菌、真菌:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后10000g,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。
3. 血清(浆):直接测定。
操作表:
1、 分光光度计/酶标仪预热30min,调节波长至665nm。
2、 操作表
空白管 |
测定管 |
|
样品(μL) |
75 |
|
H2O(μL) |
75 |
|
试剂一(μL) |
75 |
75 |
充分震荡混匀 |
||
试剂二(μL) |
75 |
75 |
10000g,4℃,离心 10min,去上清,留沉淀 |
||
H2O(μL) |
150 |
150 |
10000g,4℃,离心 10min,去上清,留沉淀 |
||
试剂一(μL) |
75 |
75 |
试剂三(μL) |
75 |
75 |
充分震荡混匀 |
||
试剂四(μL) |
75 |
75 |
12000rpm,4℃,离心 10min,取上清 |
||
试剂五(μL) |
15 |
15 |
混匀,25℃静置20min,于微量石英比色皿/96孔板中,空白管调零,测定665nm吸光值,记为 A665。
H2S含量计算公式:
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准曲线回归方程为:y=0.0044x,R2=0.9988
(1)组织样品
a.按照蛋白浓度计算
H2S(μmol/mg prot)=A665÷0.0044×V 反总÷(V 样×Cpr)×10-3 =0.727×A665 ÷Cpr
b.按照样本重量计算
H2S(μmol/g)=A665÷0.0044×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)×10-3 = 0.727×A665 ÷W
(3) 细胞
H2S(μmol/104 cell)=A665÷0.0044×V 反总÷(V 样÷V 样总×细胞数量(万个))×10 -3
=0.727×A 665 ÷细胞数量(万个)
(2)液体样品 H2S(μmol/L)=A665÷0.0044×V 反总÷V 样= 727×A665
V 反总:反应总体积,0.24mL;V 样:反应中样品体积,0.075mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;W:样品质量,g;Cpr:蛋白浓度,mg/mL
b.用 96 孔板测定的计算公式如下
标准曲线回归方程为:y=0.0022x,R2=0.9988
(1)组织样品
a.按照蛋白浓度计算
H2S(μmol/mg prot)=A665÷0.0044×V 反总÷(V 样×Cpr)×10-3 =1.454 ×A665 ÷Cpr
b.按照样本重量计算
H2S(μmol/g)=A665÷0.0044×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)×10-3 = 1.454×A665 ÷W
(3) 细胞
H2S(μmol/104cell )=A665÷0.0044×V 反总÷(V 样÷V 样总×细胞数量(万个))×10-3
=1.454×A665 ÷细胞数量(万个)
(2)液体样品 H2S(μmol/L)=A665÷0.0044×V 反总÷V 样= 1454×A665
V 反总:反应总体积,0.24mL;V 样:反应中样品体积,0.075mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;W:样品质量,g;Cpr:蛋白浓度,mg/mL
注意事项
最低检出限为8μmol/L。
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