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植物脱氢酶(Plant dehydrogenase, pDHA)试剂盒说明书
微量法
注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:
生物体的脱氢酶(Plant dehydrogenase , DHA)的活性在很大程度上反映了生物体的活性状态,能直接表示生物细胞对其基质降解能力的强弱。
测定原理:
受氢体 2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-Triphenyl Tetrazolium Chloride,即TTC)在细胞呼吸过程中接受氢以后,其还原产物三苯基甲鐟(Triphenyl Formazone,即TF)呈现红色,在波长485nm处有最大吸收峰,测定其485nm吸光值,即得植物脱氢酶活性。
需自备实验仪器及用品:
恒温培养箱或水浴锅、低温离心机、研钵、滤纸、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、冰、蒸馏水和乙酸乙酯。
试剂的组成和配制:
试剂一:粉剂×1瓶,使用前加少量水溶解,定容至50mL,避光、4℃保存(尽量现配现用)。
试剂二:液体 100mL×1瓶,4℃保存。
试剂三:乙酸乙酯,自备。
样品处理:
称取0.1g的植物组织,用双蒸水清洗3-4次,用滤纸吸干水分,备用。
测定步骤和操作表:
1、分光光度计/酶标仪预热30min,调节波长至485nm,蒸馏水调零。
2、操作表
对照管 |
测定管 |
|
样品(g) |
0.1 |
0.1 |
试剂一(mL) |
1 |
|
试剂二(mL) |
2 |
1 |
充分混匀,37℃,暗培养 3h,取出后立即冰浴 5min,过滤,去滤液,尽量用滤纸吸干样品, 置于研钵中。 |
||
试剂三(mL) |
1 |
1 |
充分研磨,吸取红色液体于离心管中,用少量试剂三冲洗研钵,一起加入离心管,用试剂三 定容至 2mL,10000rpm,4℃,离心 5min,取上清,于微量石英比色皿/96 孔板,测定 485nm 处测定管和对照管吸光值。ΔA=A 测定-A 对照 |
脱氢酶活力计算:
酶活单位定义:在37℃时,每小时每克样品使反应体系OD值每增加0.01为一个酶活单位。
计算公式:脱氢酶活性(U/g.h)=ΔA÷0.01÷W÷T
=300×ΔA÷W
T:反应时间,3h;W:样品质量,g。
注意事项:
1. 配制好的试剂一避光保存于 4℃,尽量在一周内使用,若出现红色,则不能使用。
2. 试剂三易挥发,有毒,为了您的健康,请穿实验服,戴口罩,戴乳胶手套操作。
3. 反应完成后立即冰浴以终止反应,并去除干净残留的反应液。
4. 如果测定出来的吸光值较大,需把样品适当稀释再进行测定。
5. 试剂盒 2-8℃保存。
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