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植酸酶(phytase)试剂盒说明书
微量法
注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义
植酸酶(phytase)是催化植酸及其盐类水解为肌醇与磷酸(盐)的一类酶的总称,属磷酸单酯水解酶,它能将食品和饲料中植酸及其盐转化为可供有机体利用的有效磷,降低粪便中的磷含量,减轻对环境的污染,改善营养成分的吸收和利用,因此具有极其广泛的研究和应用价值。
测定原理
植酸酶在一定温度和pH值条件下,水解底物植酸钠生成无机磷与肌醇衍生物,无机磷在酸性环境中与钼酸铵显色剂反应生成蓝色复合物,在700nm处有特征吸收峰,根据700nm处吸光值变化可计算得植酸酶活性。
自备实验用品及仪器
天平、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、恒温水浴锅,超声溶解器,回旋式振荡器。
试剂组成和配制
提取液:液体 100mL×1 瓶,4℃保存。
缓冲液:液体 10mL×1 瓶,4℃保存。
试剂一:粉剂×2 支,4℃保存, 临用前加缓冲液 4mL 配制,现用现配。
试剂二:液体 10mL×1 瓶,4℃保存。
试剂三:液体 10mL×1 瓶,4℃保存。
显色剂:粉剂×6 瓶,4℃保存,临用前根据用量每瓶加0.4mL双蒸水溶解,再加1.6mL试剂三混匀。
样本处理
1. 酶制剂:按照质量(g):提取液体积(mL)为1:500~1000的比例(建议称取约0.001g,加入1mL提取液)加入提取液,在超声波溶解器上溶解15min,再用回旋式振荡器振荡15min,待测。
2. 组织:按照质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g,加入1mL提取液)加入提取液,在超声波溶解器上溶解15min,再用回旋式振荡器振荡15min,4℃,4000g 离心10min,取上清待测。
3. 饲料样品:饲料烘干粉碎,过40目筛,按照质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g,加入1mL提取液)加入提取液,在超声波溶解器上溶解15min,再用回旋式振荡器振荡 15min,4℃,4000g 离心10min,取上清待测。
4. 培养液等液体样品,混匀直接测定。
测定操作表
对照管 |
测定管 |
|
样本(μL) |
20 |
20 |
37℃温育 5min |
||
试剂一(μL) |
80 |
|
试剂二(μL) |
100 |
|
37℃温育 30min |
||
试剂一(μL) |
80 |
|
试剂二(μL) |
100 |
|
显色剂(μL) |
100 |
100 |
室温静置10min,4000g,4℃,离心10min,取上清200μL,缓冲液调零测定700nm 处吸光值,△A=A测定管-A对照管 |
酶活性计算公式
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准曲线y=0.1084x+0.0236,R2=0.9998
1.按照蛋白浓度计算
酶活性定义:在37℃,pH5.5的条件下,每毫克蛋白每分钟从5mmol/L的植酸钠溶液中释放出1μmol的无机磷为一个酶活力单位。
植酸酶活性(μmol/min/mg prot)=(△A-0.0236)÷0.1084×V反总÷(V样×Cpr)÷T×N= 4.613×(△A-0.0236)÷Cpr×N
2.按照样本质量计算
酶活性定义:在37℃,pH5.5的条件下,每克样本每分钟从5mmol/L的植酸钠溶液中释放出1μmol的无机磷为一个酶活力单位。
植酸酶活性(μmol/min/g)=(△A-0.0236)÷0.1084×V反总÷(V样×W÷V样总)÷T×N= 4.613×(△A-0.0236)÷W×N
3. 培养液等液体样品
酶活性定义: 在37℃,pH5.5的条件下,每毫升液体每分钟从5mmol/L的植酸钠溶液中释放出1μmol的无机磷为一个酶活力单位。
植酸酶活性(μmol/min/mL)=(△A-0.0236)÷0.1084×V 反总÷V 样÷T×N
= 4.613×(△A-0.0236)×N
V 反总:反应总体积,0.3mL;V 样:反应体系中加入样本体积,0.02mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白含量,mg/mL;W:样本质量,g;N:样品稀释倍数
b. 用96孔板测定的计算公式如下
标准曲线:y=0.0542x+0.0236,R2=0.9998
2. 按照蛋白浓度计算
酶活性定义:在 37℃,pH5.5的条件下,每毫克蛋白每分钟从5mmol/L的植酸钠溶液中释放出1μmol的无机磷为一个酶活力单位。
植酸酶活性(μmol/min/mg prot)=(△A-0.0236)÷0.0542×V反总÷(V样×Cpr)÷T×N= 9.226×(△A-0.0236)÷Cpr×N
2.按照样本质量计算
酶活性定义: 在37℃,pH5.5的条件下,每克样本每分钟从5mmol/L的植酸钠溶液中释放出1μmol的无机磷为一个酶活力单位。
植酸酶活性(μmol/min/g)=(△A-0.0236)÷0.0542×V反总÷(V样×W÷V样总)÷T×N= 9.226×(△A-0.0236)÷W×N
3. 培养液等液体样品
酶活性定义: 在37℃,pH5.5的条件下,每毫升液体每分钟从5mmol/L的植酸钠溶液中释放出1μmol的无机磷为一个酶活力单位。
植酸酶活性(μmol/min/mL)=(△A-0.0236)÷0.0542×V反总÷V样÷T×N
= 9.226×(△A-0.0236)×N
V 反总:反应总体积,0.3mL;V 样:反应体系中加入样本体积,0.02mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白含量,mg/mL;W:样本质量,g;N:样品稀释倍数
注意事项
1. 试剂三 4℃保存一个月,显色剂需要临用前根据用量配制,每一瓶是20个样本的用量,新配制的显色剂若有颜色则已经污染或者试剂过期,应放弃使用。
2. 测定前先做预实验,将待测样本的浓度调整到合适的范围,并在计算公式中乘以稀释倍数。
3. 对照管与测定管加入试剂一和试剂二的顺序是相反的,务必保证加入试剂时间的一致性,以保证反应的准确性。
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