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上海优选生物科技有限公司
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糖原磷酸化酶 a（Glycogen phosphorylase a，GPa）试剂盒说明书
微量法
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
糖原磷酸化酶（Glycogen phosphorylase，GP，EC 2.4.1.1)）是糖原分解代谢的关键酶，使糖原分子从非还原端逐个断开α-1，4-糖苷键移去葡萄糖基，释放1-磷酸葡萄糖，直至临近糖原分子α-1，6-糖苷键分支点前4个葡萄糖基处。GP分为有活性的糖原磷酸化酶 a（GPa）和无活性的糖原磷酸化酶 b（GPb）两种形式。糖原的分解主要在 GPa 的催化下进行。
测定原理：
未添加激活剂时，GPa催化糖原和无机磷产生葡萄糖残基生成糖原和1-磷酸葡萄糖，磷酸葡萄糖变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步依次催化NADP还原生成NADPH，在340nm下测定NADPH上升速率，即可反映GPa活性。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
提取液：100mL×1 瓶，4℃保存；
试剂一：液体 16 mL×1 瓶， 4℃保存；
试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃保存；
试剂三：粉剂×1 支，-20℃保存；
试剂四：粉剂×1 支， -20℃保存；
样本的前处理：
按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
测定步骤：
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零；
2、工作液的配制：临用前将试剂二转移到试剂一中混合溶解待用；用不完的试剂4℃可保存一周；
3、试剂三的配制：临用前在试剂三管中加入1mL蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂4℃可保存一周；
4、试剂四的配制：临用前在试剂四管中加入1mL蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂4℃可保存一周；
5、将工作液、试剂三和试剂四置于37℃预热5分钟；
6、在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、10μL试剂三、10μL试剂四、10μL蒸馏水和160μL工作液，立即混匀，记录340nm处5min后的A1和10min后的吸光值A2，计算 ΔA=A2-A1。
GPa 活性计算：
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下：
（1）按样本蛋白浓度计算
单位定义：每mg组织蛋白每分钟产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
GPa（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T
=643×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
单位定义：每g组织每分钟产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
GPa（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W×V 样÷V 样总)÷T
=643×ΔA÷W
V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。
b.用96孔板测定的计算公式如下：
（1）按样本蛋白浓度计算
单位定义：每mg组织蛋白每分钟产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
GPa（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T
=1286×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
单位定义：每g组织每分钟产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
GPa（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T
=1286×ΔA÷W
V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm；d：96 孔板光径，0.05cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。
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