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植物叶绿体中磷酸丙糖异构酶
(Triose-phosphate isomerase,TPI)试剂盒说明书
紫外分光光度法
注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
产品内容:
提取液一:液体50mL×1瓶,4℃保存。
提取液二:液体25mL×1瓶,4℃保存。
试剂一:液体30mL×1瓶,4℃保存。
试剂二:粉剂×1瓶,-20℃避光保存。临用前加5mL蒸馏水充分溶解。
试剂三:粉剂×1瓶,-20℃避光保存。临用前加5 mL蒸馏水充分溶解。
试剂四:粉剂×1瓶,-20℃避光保存。临用前加5 mL蒸馏水充分溶解。
产品说明:
植物叶绿体中磷酸丙糖异构酶是光合作用中参与calvin循环的重要酶。作用于磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮之间的转化,磷酸二羟丙酮能快速透过叶绿体的包膜进入细胞质,并在其中逐步转化为蔗糖。
磷酸丙糖异构酶将磷酸二羟丙酮转化为3-磷酸甘油醛,3-磷酸甘油醛与NAD在3-磷酸甘油醛脱氢酶的作用下生成3-磷酸甘油酸和NADH,340nm处的吸光度变化反映了磷酸丙糖异构酶的活性的高低。
自备仪器和用品:
天平、低温离心机、研钵、震荡仪、紫外分光光度计、1 mL石英比色皿。
操作步骤:
一、酶液提取
按照植物组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g,加入1mL提取液一)加入提取液一,冰浴匀浆后于4℃,1000g离心5min,取上清在4℃,4500g离心20min,去上清,取沉淀加0.5mL提取液二,置于震荡仪上震荡30s溶解,置冰上30min,重复操作一次(或者震荡溶解后超声,超声条件为功率200W,破碎3s,间歇7s,总时间1min),然后4℃,12000g离心10min,取上清待测。
二、测定操作
1. 分光光度计预热30min,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2. 取1mL石英比色皿,依次加入600μL试剂一,100μL试剂二,100μL试剂三,100μL试剂四,100μL粗酶液,充分混匀,记录340nm处10s的吸光值A1和310s的吸光值A2,△A=A2-A1
三、浓度计算:
(1) 按照样本蛋白浓度计算
酶活单位定义:每毫克组织蛋白每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
TPI(nmol/min /mg prot)= ΔA÷(ε×d)×V反总÷(V样×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr
(2)按照样本质量计算
酶活单位定义:每克组织每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
TPI(nmol/min /g)= ΔA÷(ε×d)×V反总÷(W ×V样÷V样总) ÷T=160.77×ΔA÷W
V反总:反应体系总体积,1mL;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.1mL;V样总:加入提取液体积,0.5mL;T:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g
注意事项:
配置好的试剂二、试剂三、试剂四3天内使用完。
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联系人:
伍雅君
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