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焦磷酸：果糖-6-磷酸-1-磷酸转移酶（Pyrophosphate: fructose-6 –
phosphate-1-phosphoric acid transferase ，PFP ）试剂盒说明书
微量法
注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义
焦磷酸：果糖-6-磷酸-1-磷酸转移酶（PFP，EC2.7.1.90）是一种胞质酶，广泛存在于植物组织中，催化果糖-6-磷酸与果糖-1,6-二磷酸之间的可逆转化，在光合作用碳代谢中起重要作用。
测定原理
PFP催化6-磷酸果糖转化为 1,6-二磷酸果糖，它在醛缩酶和磷酸丙糖异构酶的作用下转变为3-磷酸甘油醛，再由3-磷酸甘油醛脱氢酶和NADH催化生成3-磷酸甘油酸、NAD 和磷酸，340nm处的吸光度变化反映了 PFP 的活性的高低。
自备实验用品及仪器
天平、低温离心机、研钵、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板。
试剂组成和配制
提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：液体 10mL×1 瓶，4℃避光保存。
试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃避光保存。临用前加 2mL 蒸馏水充分溶解。
试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃避光保存。临用前加 2mL 蒸馏水充分溶解。
试剂四：液体 0.5mL×1 瓶，4℃避光保存。
试剂五：液体 0.5mL×1 瓶，4℃避光保存。
试剂六：液体 2mL×1 瓶，4℃避光保存。
酶液提取
1. 组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于 4℃，10000g 离心10min，取上清置冰上待测。
2. 细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后 4℃，10000g 离心 10min，取上清置冰上待测。
3. 液体：直接检测。
测定操作
1. 紫外分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2. 取微量石英比色皿/96 孔板，依次加入100μL试剂一，20μL试剂二，20μL试剂三，10μL 试剂四，10μL试剂五，20μL试剂六，20μL粗酶液，充分混匀，记录340nm处10s的吸光值A1和310s的吸光值A2，△A=A1-A2
计算公式
a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
（1）按照样本蛋白浓度计算
酶活单位定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
PFP（nmol/min/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V 反总÷(V 样×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr
（2）按照样本质量计算
酶活单位定义：每克组织每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
PFP（nmol/min/g）=ΔA÷（ε×d）×V 反总÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=321.54×ΔA÷W
（3）按照细胞数量计算
酶活单位定义：每104个细胞每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
PFP（nmol/min/104cell）= ΔA÷（ε×d）×V 反总÷(V 样×细胞数量÷V 样总) ÷T
=321.54×ΔA÷细胞数量
（4）按照液体体积计算
酶活单位定义：每毫升液体每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
PFP（nmol/min/mL）＝ΔA÷（ε×d）×V 反总÷V 样÷T=321.54×ΔA
V 反总：反应体系总体积，0.2mL；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.02mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g
b.使用 96 孔板测定的计算公式如下
（1）按照样本蛋白浓度计算
酶活单位定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
PFP（nmol/min/mg prot）＝ΔA÷（ε×d）×V反总÷(V样×Cpr) ÷T= 643.08×ΔA÷Cpr
（2）按照样本质量计算
酶活单位定义：每克组织每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
PFP（nmol/min/g）＝ΔA÷（ε×d）×V 反总÷(W ×V样÷V样总) ÷T
= 643.08×ΔA÷W
（3）按照细胞数量计算
酶活单位定义：每104个细胞每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
PFP（nmol/min /104cell）= ΔA÷（ε×d）×V 反总÷(V 样×细胞数量÷V 样总) ÷T
= 643.08×ΔA÷细胞数量
（4）按照液体体积计算
酶活单位定义：每毫升液体每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
PFP（nmol/min /mL）＝ΔA÷（ε×d）×V 反总÷V 样÷T= 643.08×ΔA
V 反总：反应体系总体积，0.2mL；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.02mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g
注意事项
配置好的试剂二、试剂三 3 天内使用完。
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伍雅君
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