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NAD激酶（NAD kinase, NADK）试剂盒说明书
微量法
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
NADK（EC 2.7.1.23）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是目前所发现的生物体内惟一能够催化 NAD+磷酸化生成 NADP+的酶，可催化NAD(H)以ATP或无机多聚磷酸[poly(P)]作为磷酰基供体进行磷酸化反应，生成 NADP(H)。因此，NAD激酶在合成 NADP(H)
以及调节NAD(H)与NADP(H)的平衡上具有重要作用。
测定原理：
NADK 催化NAD+磷酸化，生成NADP+；NADP+可被 6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原为NADPH；NADPH 通过PMS的递氢作用，还原氧化型噻唑蓝（MTT），通过在600 nm下测定MTT的还原速度（吸光值的变化）可反映出NADK活性的大小。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
提取液：液体 100 mL×1 瓶，4℃保存；
试剂一：液体 10 mL×1 瓶，4℃保存；
试剂二：液体 25 mL×1 瓶，4℃保存；
试剂三：粉剂×1 瓶，-20 ℃保存；
试剂四：粉剂×1 瓶，-20℃保存；
试剂五：粉剂×1 瓶，-20℃保存；
样本测定的准备：
1、细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样品：直接检测。
测定步骤
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至600nm，蒸馏水调零。
2、将试剂一和试剂二 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 15min 以上。
3、工作液Ⅰ的配制：在试剂三中加入8mL试剂一，充分混匀待用；现配现用；
工作液Ⅱ的配制：在试剂四中加入11mL试剂二，充分混匀待用；用不完的试剂4℃保存一周；
工作液Ⅲ的配制：在试剂五中加入11mL试剂二，充分混匀待用；用不完的试剂4℃保存一周；
4、加样表
试剂名称(μL) |
测定孔 |
样本 |
20 |
工作液Ⅰ |
80 |
充分混匀，37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 15min，立即煮沸2min（盖紧，防止水分散失）冰浴冷却，10000g，25℃离心 10min，取上清 |
|
上清液 |
25 |
工作液Ⅱ |
110 |
工作液Ⅲ |
110 |
加完试剂混匀后立即在600n下测定30秒的吸光值A1和3分钟30 秒时的吸光值A2，计算△A= A2-A1
NADK 活性计算：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准条件下测定的回归方程为y = 0.002463x +0.004；x 为NADP标准品浓度（nmol/mL），y为吸光值。
（1） 按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟产生 1 nmol NADP 定义为一个酶活力单位。
NADK（nmol/min/mg prot）=[406×（△A - 0.004）×V1]÷（V1×Cpr）÷T
=135.3×（△A - 0.004）÷Cpr
需要另外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每 g 组织每分钟产生 1 nmol NADP 定义为一个酶活力单位。
NADK（nmol/min/g 鲜重）=[406×（△A - 0.004）×V1]÷(W×V1÷V2）÷T
=135.3×（△A - 0.004）÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟产生1nmol NADP定义为一个酶活力单位。
NADK（nmol/min/104cell）=[406×（△A - 0.004）×V1]÷（500×V1÷V2）÷T
=0.271×（△A -0.004）
V1：加入反应体系中样本体积，0.02mL；V2：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，3min；
Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； W：样本质量，g;；500：细胞或细菌总数，500 万。
b.用96孔板测定的计算公式如下
标准条件下测定的回归方程为y = 0.001232x +0.004；x 为NADP标准品浓度（nmol/mL），y为吸光值。
（1） 按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟产生1nmol NADP定义为一个酶活力单位。
NADK（nmol/min/mg prot）=[812×（△A - 0.004）×V1]÷（V1×Cpr）÷T
=270.6×（△A - 0.004）÷Cpr
需要另外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟产生1nmol NADP定义为一个酶活力单位。
NADK（nmol/min/g 鲜重）=[812×（△A - 0.004）×V1]÷(W×V1÷V2）÷T
=270.6×（△A - 0.004）÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟产生1nmol NADP定义为一个酶活力单位。
NADK（nmol/min/104cell）=[812×（△A - 0.004）×V1]÷（500×V1÷V2）÷T
=0.542×（△A -0.004）
V1：加入反应体系中样本体积，0.02mL；V2：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，3min；
Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； W：样本质量，g;；500：细胞或细菌总数，500 万。
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