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NADH氧化酶（NOX）生化检测测定

价格	￥35.00/样	￥31.00/样
起订量	≥10	≥50
所在地	上海上海	可售量 10000样

联系人：伍雅君

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基本参数

品牌	优选生物/Sinobestbio	产地	上海
产品等级	优级品	产品用途	生化测定
用途	科研检测

NADH 氧化酶（NADH oxidase，NOX）试剂盒说明书

微量法

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

NOX（EC 1.6.99.3）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，可在氧气存在下，直接将NADH氧化为NAD。该酶不仅参与NAD的再生，而且与免疫反应密切相关。

测定原理：

NOX能够将NADH氧化为NAD，NADH的氧化 2,6 二氯酚靛蓝（DCPIP）的还原相偶联，蓝色的 DCPIP被还原为无色的DCPIP，在600nm下测定蓝色DCPIP的还原速率计算出NADH氧化酶活性的大小。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰、蒸馏水

试剂的组成和配制：

试剂一：液体 100mL×1 瓶，-20℃保存；

试剂二：液体 20mL×1 瓶，-20℃保存；

试剂三：液体 1.5mL×1 瓶，-20℃保存；

试剂四：液体 25mL×1 瓶，4℃保存。

试剂五：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前加入 5mL 蒸馏水，现配现用。

样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

① 准确称取0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL试剂一和10uL试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

② 将匀浆 600g，4℃离心 5min。

③ 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11100g，4℃离心10min。

④ 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的 NOX（此步可选做）。

⑤ 步骤④中的沉淀即为线粒体，加入200uL试剂二和2uL试剂三，超声波破碎（冰浴，功率 20％或200W，超声3s，间隔10秒，重复30次），用于NOX活性测定。

血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至600nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

（1）试剂四于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min。

（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、200μL试剂四和40μL试剂五，混匀，记录600nm处20s时吸光值A1和1min20s 后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。

NOX 活力单位的计算

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、血清（浆）NOX活力的计算:

单位的定义：每mL血清（浆）在每mL反应体系中每分钟A600变化0.01定义为一个酶活力单位。

NOX（U/mL）＝ΔA×V 反总÷V 样÷0.01÷T=2500×ΔA

2、组织、细菌或细胞中 NOX 活力的计算:

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白在每mL反应体系中每分钟A600变化0.01定义为一个酶活力单位。

NOX（U/mg prot）=ΔA×V 反总÷（V 样×Cpr）÷0.01÷T=2500×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织在每mL反应体系中每分钟A600变化0.01定义为一个酶活力单位。

NOX（U/g 鲜重）=ΔA×V 反总÷(W× V 样÷V 样总)÷0.01÷T=505×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞在每mL反应体系中每分钟A600变化0.01定义为一个酶活力单位。

NOX（U/10⁴cell）=ΔA×V 反总÷(500×V 样÷V 样总)÷0.01÷T=1.01×ΔA

V 反总：反应体系总体积，0.25mL；V 样：加入样本体积，0.01mL；V 样总：加入提取液体积，0.202mL；T：反应时间，1min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量；500：细胞或细菌总数，500 万。

b.使用 96 孔板测定的计算公式如下：

1、血清（浆）NOX 活力的计算:

单位的定义：每mL血清（浆）在每mL反应体系中每分钟A600变化0.005定义为一个酶活力单位。

NOX（U/mL）＝ΔA×V 反总÷V 样÷0.01÷T=5000×ΔA

2、组织、细菌或细胞中 NOX 活力的计算:

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白在每mL反应体系中每分钟A600变化0.005定义为一个酶活力单位。

NOX（U/mg prot）=ΔA×V 反总÷（V 样×Cpr）÷0.005÷T=5000×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织在每mL反应体系中每分钟A600变化0.005定义为一个酶活力单位。

NOX（U/g 鲜重）=ΔA×V 反总÷(W× V 样÷V 样总)÷0.005÷T=1010×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞在每mL反应体系中每分钟A600变化0.005定义为一个酶活力单位。

NOX（U/10⁴cell）=ΔA×V 反总÷(500×V 样÷V 样总)÷0.005÷T=2.02×ΔA

V 反总：反应体系总体积，0.25mL； V 样：加入样本体积，0.01mL；V 样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量；500：细胞或细菌总数，500 万。

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上海市浦东新区港澳路271号1幢2层

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