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上海优选生物科技有限公司
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肌酸激酶（Creatine Kinase, CK）测定试剂盒说明书
微量法
注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
CK(EC 2.7.3.2)主要存在于心脏、肌肉以及脑等组织中，能可逆地催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应，在能量运转、肌肉收缩和ATP再生中有重要作用，是临床诊断心脑疾病的一个重要指标。
测定原理：
CK催化磷酸肌酸和ADP生成肌酸和ATP，己糖激酶催化ATP与葡萄糖形成6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脱氢酶催化6-磷酸葡萄糖与NADP+生成NADPH，导致340nm光吸收值增加。
自备实验用品及仪器：
天平、低温离心机、恒温水浴锅、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板和蒸馏水。
试剂组成和配制：
提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：粉剂 1 瓶，4℃避光保存，使用前加 10mL 蒸馏水溶解。
试剂二：液体 10mL×1 瓶，4℃保存。
工作液：临用前根据用量将试剂一和试剂二以 1:1 混合。使用前 37℃温育 2min。
粗酶液提取：
1. 组织样本：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃，离心15min。
2. 血清样本：直接测定。
测定操作表：
1. 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长至340nm。
2．操作表
空白管 |
测定管 |
|
酶液（μL） |
60 |
|
工作液（μL） |
150 |
150 |
H2O（μL） |
150 |
90 |
混匀，取200μL于微量石英比色皿/96孔板中，测定管调零，测定340nm的初始值A1，37℃反应 3min，分别测定 1min，2min，3min 时的吸光值A2 ，计算时取平均值，△A=A2-A1 。 |
||
注意：空白管只需测定一次。
CK 活性计算公式：
a． 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
（1）按组织蛋白含量计算
酶活定义：37℃，pH7.0时，每毫克蛋白质1min内催化产生1nmol NADPH为一个酶活单位。
CK 活性（nmol/min/mg prot）=△A÷e÷d×V 反总÷（V 样×Cpr）= 804×△A÷Cpr
（2）按组织样本质量计算：
酶活定义：37℃，pH7.0时，每克样品1min内催化产生1nmol NADPH为一个酶活单位。
CK 活性（nmol/min/g）=△A÷e÷d×V 反总÷（V 样÷V 样总×W）= 804×△A÷W
（3）按血清计算：
酶活定义：37℃，pH7.0时，每升血清1min内催化产生1nmol NADPH为一个酶活单位。
CK 活性（nmol/min/L）=△A÷e÷d×V 反总÷V 样×1000= 804000×△A
e：NADPH 微摩尔消光系数，6220 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应体系总体积，0.3mL；V 样：反应体系中样本体积，0.06mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g
b．用 96 孔板计算公式如下
（1）按组织蛋白含量计算
酶活定义：37℃，pH7.0时，每毫克蛋白质1min内催化产生1nmol NADPH为一个酶活单位。
CK 活性（nmol/min/mg prot）=△A÷e÷d×V 反总÷（V 样×Cpr）= 1608×△A÷Cpr
（2）按组织样本质量计算：
酶活定义：37℃，pH7.0 时，每克样品1min内催化产生1nmol NADPH为一个酶活单位。
CK 活性（nmol/min/g）=△A÷e÷d×V 反总÷（V 样÷V 样总×W）= 1608×△A÷W
（3）按血清计算：
酶活定义：37℃，pH7.0时，每升血清1min内催化产生1nmol NADPH为一个酶活单位。
CK 活性（nmol/min/L）=△A÷e÷d×V 反总÷V 样×1000= 1608000×△A
e：NADPH 摩尔消光系数，6220 L/mol/cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V 反总：反应体系总体积，0.3mL；V 样：反应体系中样本体积，0.06mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g
注意事项：
1. 配制好的工作液 4℃稳定 7 天，请尽量配制后尽快使用。
2. 血清的 CK 不稳定，采集样本后尽快测定，4℃避光保存可稳定 24h。
3. 样品蛋白质含量需要另外测定，可选用 BCA 蛋白含量测定试剂盒进行测定。
4. OD 值大于 0.5 可用提取液适当稀释样品，并在计算公式中相应的改变稀释倍数。
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