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γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶（GCL）生化检测测定

价格	￥37.00/样	￥33.00/样
起订量	≥10	≥50
所在地	上海上海	可售量 10000样

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基本参数

品牌	优选生物/Sinobestbio	产地	上海
产品等级	优级品	产品用途	生化测定
用途	科研检测

γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶（GCL）说明书

微量法

注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

GCL是GSH合成的限速酶，GSH对GCL有反馈抑制作用。GCL基因表达受多种因素调节，如氧化剂、抗氧化剂、生长因子和炎症因子等。GCL活性高低对GSH含量和GSH/GSSG比值有重要影响。

测定原理：

在ATP和Mg²⁺存在下，GCL催化谷氨酸和半胱氨酸合成γ-谷氨酰半胱氨酸；同时ATP去磷酸化产生无机磷分子，通过测定无机磷增加速率，即可计算出GCL活性。

自备仪器和用品：

冷冻离心机、水浴锅、移液器、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、浓硫酸和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体×1 瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加6mL蒸馏水充分震荡溶解。

试剂三：粉剂×1 管，4℃保存。临用前加入蒸馏水1.5mL充分震荡溶解。

试剂四：液体×1 瓶，室温保存。

试剂五：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入12 mL蒸馏水，充分震荡溶解后，缓缓加入400μL浓硫酸（自备），边加边搅拌。

粗酶液提取：

1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2. 细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

3. 血清等液体：直接测定。

GCL 测定操作：

1. 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到660nm，蒸馏水调零。

2. 空白管：取1.5mLEp管，依次加入试剂一72μL、试剂二52μL 和试剂三12μL，混匀后盖紧，37℃水浴准确反应15min；再加入试剂四60μL，混匀后，室温（25℃左右）8000g，离心10 min，取上清100μL，加入试剂五100μL，混匀后盖紧，45℃水浴10min，冷却后测定660nm处光吸收，记为A空白管。

3. 测定管：取1.5mL Ep管，依次加入试剂一48μL、试剂二52μL、试剂三12μL和上清液24μL，混匀后盖紧，37℃水浴准确反应15 min；再加入试剂四60μL，混匀后，室温（25℃左右）8000g，离心10min，取上清100μL，加入试剂五100μL，混匀后盖紧，45℃水浴10min，冷却后测定660nm 处光吸收，记为A测定管。

注意：空白管只需测定一次。

GCL 活性计算公式：

标准曲线：y=0.1427x，R²=0.9987

a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1). 按蛋白浓度计算

活性单位定义：37℃下，每毫克蛋白每分钟催化产生1μg无机磷的GCL酶活量为1个酶活单位。

GCL（μg/min /mg prot）=[（A 测定管-A 空白管）÷0.1427×V 反总]÷(Cpr×V 样)÷T

=3.815×（A 测定管-A 空白管）÷Cpr

（2）按样本质量计算

活性单位定义：37℃下，每克组织每分钟催化产生1μg无机磷的 GCL酶活量为1个酶活单位。

GCL（μg/min/g）= [（A 测定管-A 空白管）÷0.1427×V 反总]÷(W×V 样÷V 样总)÷T

= 3.815×（A 测定管-A 空白管）÷W