氨基磁珠高密度氨基磁珠聚合物氨基磁性微球 G-NH2amine magnetic bead

一、概述

氨基磁珠（G-NH2）是具有-NH2表面官能团的超顺磁微球，由Fe3O4核和GMA涂层组成。通过GMA的化学修饰，-NH2基团通过短的亲水性连接臂连接到氨基磁珠上。亲水表面确保氨基磁珠在各种缓冲液中具有出色的分散性和易操作性。具有表面反应性胺基的磁珠允许配体如蛋白质、肽、碳水化合物或其它特异性分子的固定。配体的固定可以通过醛或酮的还原胺化而不预先活化氨基磁珠表面。或者，EDC交联剂可用于羧基将配体与胺偶联。最后，胺反应性双功能交联剂可用于引入其他官能团以偶联配体。

G-NH2可以用肽、酶、碳水化合物等包被以分离不同的靶标，如激素、受体、凝集素、疾病标志物、噬菌体。一旦与配体结合后，将氨基磁珠加到含目标分子的样品中，短时间孵育后，可通过磁珠亲和捕获靶标。磁分离可除去不需要的上清液，洗涤目标结合的磁珠以得到纯样品。氨基磁珠结合的靶标可直接用于生物测定，并在SDS-PAGE上分析。用常规洗脱方法可将目标分子从磁珠上洗脱下来。

二、产品特性

1. 短臂氨基磁珠 GS-NH2

基团密度 600 umoles amine/g beads

2.长臂氨基磁珠GL- NH2

氨基密度 300 μmoles amine/g beads

形态：超顺磁球形

直径：200 nm

储存：10 mg/mL ，去离子水中 2~8 °C保存，勿冻结。

常温运输，正确使用保存期一年。

方案1.用于连接醛和酮

含有醛和酮的配体可通过形成Schiff's碱与氨基磁珠偶联，并用氰基硼氢化钠还原胺化。醛基可通过高碘酸钠氧化糖蛋白中的糖残基或多糖中相邻羟基的C-C键的裂解而容易地制备。

缓冲液

?偶联缓冲液 Coupling Buffer (0.1M sodium phosphate, 0.15M NaCl or 100mM sodium borate, pH9.5 or 100mM sodium citrate, pH9.5);

? 5M Sodium Cyanoborohydride in 1M NaOH;

? 0.1M Ethanolamine, pH7.4;

清洗氨基磁珠

1. 彻底重悬氨基磁珠并转移足量磁珠到干净EP管中。

2. 将EP管置于磁力架上60秒，并吸弃上清液。

3. 从磁力架上取下EP管，加入200μl偶联缓冲液并重悬氨基磁珠。

4. 将EP管置于磁力架上60秒，并吸弃上清液。

5. 用上述缓冲液清洗两次。

配体的结合

1. 将配体溶解偶联缓冲液中至浓度1-10 mg/ml。

2. 将适量的配体加入洗过的氨基磁珠并混匀。

3. 每100μl反应混合物中加入1μl的5M氰基硼氢化钠（溶于1M NaOH溶液），室温下孵育2小时。

4. 将EP管置于磁力架上60秒，并吸弃上清液。

5. 加入反应混合物相同体积的0.1M乙醇胺，并在室温下旋转孵育15分钟。

6. 将EP管置于磁力架上60秒，并吸弃上清液。

7. 加入适量的PBS并混匀氨基磁珠。

8. 将EP管置于磁力架上60秒，并吸弃上清液。

9. 重复步骤7-8两次。

方案2. 用NHS交联剂活化

最常见的一类活化剂是NH。根据交联剂的性质，可与待固定的配体中的化学基团反应，包括胺、巯基、羧基和羟基以及非选择性光反应。NHS交联剂通常必须在使用前新配。与待固定的配体量相比，使用10倍摩尔过量。

缓冲液

?偶联缓冲液Coupling Buffer (0.1 M sodium phosphate buffer with 0.15 M NaCl, pH 7.4);

? 0.05 M Tris, pH 7;

清洗氨基磁珠

1. 彻底重悬氨基磁珠并转移足量磁珠到干净EP管中。

2. 将EP管置于磁力架上60秒，并吸弃上清液。

3. 从磁力架上取下EP管，加入200μl偶联缓冲液并重悬磁珠。

4. 将EP管置于磁力架上60秒，并吸弃上清液。

5. 用上述缓冲液清洗两次。

氨基磁珠的活化

1. 用偶联缓冲液重悬氨基磁珠。

注意：避免含有氨基的缓冲液如Tris或甘氨酸，因为它们会与NHS反应竞争。

2. 根据制造商的说明溶解NHS，并将所需体积加入磁珠，混匀。可将水溶性NHS直接加入磁珠中。最终体积应等于小瓶中最初的液体体积。

3. 在室温下孵育30分钟。

4. 将EP管置于磁力架上60秒，并吸弃上清液。用上面的缓冲液洗两次。

5. 磁珠活化完成。

方案2-1.用-NH2反应性的NHS-酯交联剂活化后偶联

使用同双功能交联剂时，第二个NHS-酯基团将与配体中的-NH2反应，因此通常用于固定肽或蛋白质的N-末端。步骤如下：

1. 重新悬浮活化的氨基磁珠。使用相同的缓冲液将体积调整到所需的磁珠浓度。

2. 加入计算后一定量的配体，混匀。

3. 室温下孵育30分钟或4°C下缓慢倾斜旋转2小时。

4. 孵育后，将试管置于磁铁上2分钟，取出上清液。

5. 加入0.05M 的Tris（pH7）并在室温下温育15分钟以猝灭未反应的活性氨基。

6.用偶联缓冲液洗涤磁珠两次。

。

方案2-2.用-SH反应性的NHS-酯交联剂活化后偶联

巯基活性基团通常是吡啶二硫基或碘代/溴代乙酰基。寡核苷酸也可使用马来酰亚胺。适当的缓冲液和孵育条件与巯基反应，配体须含待固定的游离巯基。

1. 重新悬浮活化的磁珠。根据所选的巯基反应基团使用缓冲液（请参见下表）。使用相同的缓冲液将体积调整到所需的磁珠/配体浓度。

2. 加入计算量的游离巯基配体，涡旋混匀。

3. 按下表推荐的时间和温度孵育。

4. 孵育后，可加入半胱氨酸至终浓度为5mM以淬灭未反应基团。室温下孵育15分钟。

5.如所述洗涤偶联的磁珠。

SH-reactive group	Recommended buffer	Recommended condition
Maleimide	0.1M sodium phosphate pH 6.5-7.5	4 h at 4℃ or 2 h at room temperature
Iodo/ Bromoacetyl	0.05M sodium borate pH8.3	1h, room temperature. Protect from light.
Pyridyldithio	Phosphate buffered saline (PBS) pH7.5	Over night at room temperature

方案2-3.用光反应性的NHS-酯交联剂活化后偶联

光反应基团如羟苯基叠氮化物、硝基苯叠氮化物、苯叠氮化物或全氟芳基叠氮化物等可与胺基反应。带有光反应基团的交联剂的活化必须在暗室条件下进行。

1. 重新悬浮活化的氨基磁珠。根据活性基团选择缓冲液。用相同缓冲液将体积调整到所需的磁珠/配体浓度。

2. 加入计算后一定量的配体，混匀。

3. 使用推荐的时间、温度、适当波长的光照射。

注意：磁珠可能会熄灭光，因此须优化。

4.将偶联的磁洗两次。

注意：磁珠与DMF等有机溶剂相容，上述活化和偶联均可在干燥有机溶剂中进行。这将消除竞争性水解反应，因此通过延长反应时间可获得更高产率。将磁珠从有机溶剂移至缓冲液之前，用纯水洗涤一次。

方案3. 用EDC活化偶联

在配体中不存在其它伯氨基的条件下，通过使用EDC或EDC / NHS（或其他碳化二亚胺）可将磁珠表面的胺基和配体上的羧基偶联。 EDC与羧基反应形成胺反应性中间体。羧基的EDC活化产生非常不稳定的中间体，迅速水解，因此配体需快速添加。或者，可使用NHS的两步法方案来产生较稳定的中间体在较长时间内反应。这两种方法的方案如下。

缓冲液

偶联缓冲液Coupling Buffer (0.1M MES Buffer, 0.9% NaCl);

注意：对于使用EDC的偶联反应，避免使用含游离胺或磷酸盐的缓冲液，因为这会干扰偶联效率。Tris，乙酸盐和甘氨酸缓冲液都易与EDC或偶联中间体反应。还应避免含硫醇缓冲液，因为它们不可逆地结合EDC并抑制偶联。

1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC);

Sulfo-NHS or N-hydroxysuccinimide (NHS);

封闭缓冲液Quenching Buffer (50mM Tris, pH 8.0 or 5-10mM Hydroxylamine);

PBS;

清洗氨基磁珠

1. 彻底重悬氨基磁珠并转移足量磁珠到干净EP管中。

2. 将EP管置于磁力架上60秒，并吸弃上清液。

3. 从磁力架上取下EP管，加入200μl偶联缓冲液并重悬磁珠。

4. 将EP管置于磁力架上60秒，并吸弃上清液。

5. 用上述缓冲液清洗两次。

使用NHS进行两步活化偶联

1. 用偶联缓冲液配制50 mg/ml的EDC溶液；用偶联缓冲液配制50 mg/ml的sulfo-NHS或NHS溶液。

注：EDC溶液和NHS溶液应新配，避光保存在冰上。

2. 将60μl的偶联缓冲液、20μl的EDC溶液和20μl的NHS溶液加入洗好的磁珠中，混匀。

3. 在室温下孵育15分钟。

4. 将EP管置于磁力架上60秒，并吸弃上清液。

5. 加入含0.1-3mg/ml抗体或配体的50μl的偶联缓冲液并重悬磁珠。

6. 在室温下倾斜旋转30分钟或在4°C过夜孵育。

7. 将EP管置于磁力架上60秒，并吸弃上清液。

8. 加入100μl的偶联缓冲液并重悬磁珠。

9. 将EP管置于磁力架上60秒，并吸弃上清液。

10. 转到封闭磁珠方案封闭未反应基团。

使用EDC一步活化偶联

1. 用偶联缓冲液配制50mg / ml的EDC溶液。

注：EDC溶液应新配，避光保存在冰上。

2. 加入含有0.1?3mg/ml抗体或配体的50μl的偶联缓冲液并重悬磁珠。

3. 将60μl的偶联缓冲液和20μl的EDC溶液加入洗好磁珠中，混匀。

4. 在室温下孵育30分钟。

5. 将EP管置于磁力架上60秒，并吸弃上清液。

6. 加入100μl的偶联缓冲液并重悬磁珠。

7. 将EP管置于磁力架上60秒，并吸弃上清液。

8. 重复步骤6?7两次。

9. 转到封闭磁珠方案封闭未反应基团。

封闭磁珠

1. 加入500μl封闭缓冲液并重悬磁珠。

2. 在室温下孵育30分钟。

3. 将EP管置于磁力架上60秒，并吸弃上清液。

4. 加入500μl封闭缓冲液并重悬磁珠。

5. 将EP管置于磁力架上60秒，并吸弃上清液。

6. 加入500μL的PBS，pH7.4（或优选的缓冲液）并重悬磁珠。将EP管置于磁力架上60秒，并吸弃上清液。重复洗涤两次。

7. 加入100μL的PBS，pH7.4（或优选的缓冲液）并重悬磁珠，4°C储存。

附录1：免疫共沉淀分析

1. 将至少100μl含有靶抗原的细胞裂解物样品加入到来自步骤7的磁珠管中并涡旋10秒。

2. 室温孵育30分钟或4°C过夜，轻轻摇动。

3. 将试管置于磁力架上60秒，弃去上清液，然后从磁力架上取下试管。

4. 加入200μl洗涤缓冲液并重新悬浮磁珠。将试管置于磁力架上60秒，弃去上清液，然后从磁力架上取下EP管。再洗两次去除未结合的抗原。

5. 采用SDS-PAGE和蛋白质印迹分析，加入适量的SDS-PAGE上样缓冲液并在95°C加热磁珠5分钟。将磁珠/上样缓冲液混合物直接加到SDS-PAGE凝胶上，并按正常进行电泳和印迹。

抗体和抗原的排除

1. 向磁珠、抗体、抗原混合物中加入20μl洗脱缓冲液并重悬磁珠。

2. 在室温下孵育2分钟。

3. 将EP管放在磁力架上60秒。

4. 将上清液收集到干净的EP管中，然后加入2μl中和缓冲液（例如1M Tris-HCl，pH8.5）调节pH。

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