mRNA纯化磁珠 G-Oligo (dT)25磁珠
价格 | ¥1500.00/盒 | |
起订量 | ≥1 | |
所在地 | 江苏 苏州 | 可售量 10000盒 |
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货号 | CAS号 | 编号 | 包装 | 参数 | 库存 | 补货期 | 价格 |
BK2021081222 | CAS | BK2021081222 | 100 | 0 |
一、概述
G-Oligo (dT)25磁珠用于从总 RNA或直接从动物组织、植物细胞中快速分离出高纯度且完整的mRNA。可以广泛应用到各种样品中。磁珠上的 oligo-dT 与 mRNA的 polyA杂交,仅需几步洗涤、洗脱和磁分离,即可获得高纯度的mRNA。所有操作都在单管中一次完成,操作简单易行。
二、产品特性
粒径:200 nm
结合能力:~2 ug mRNA/mg bead
(注意:每mg磁珠可纯化~ 2 μg mRNA.一个典型动物细胞含10–30pg的RNA,其中1–5%是mRNA.每mL磁珠可纯化10μg的mRNA,若磁珠重复利用5次,则每mL磁珠可纯化50μg的mRNA。)
浓度:5 mg/mL
保存液:0.1 M Tris-HCl,pH 7.5, 20 mM EDTA,含0.1%(v/v)Tween -20,0.1%(w/v)NaN3
储存:2~8 °C保存,勿冻结。常温运输,正确使用保存期一年。
三、缓冲液
结合缓冲液:20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1.0 M LiCl, 2 mM EDTA.
裂解/结合缓冲液:100 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM LiCl, 10 mM EDTA, 1% LiDS, 5 mM dithiothreitol (DTT).
洗涤液A:10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.15 M LiCl, 1 mM EDTA, 0.1% LiDS.
洗涤液B:10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.15 M LiCl, 1 mM EDTA 10 mM Tris-HCl, pH 7.5.
四、注意事项
实验操作:在进行RNA实验时,必须注意要抑制RNase的作用。因此,除了要防止通过使用器具以及试剂中混入RNase,即注意实验环境之外,还要防止通过唾液、汗等混入RNase,建议戴上口罩和手套。
器材:在实验器材允许情况下,对一次性塑料制品高温高压湿热灭菌处理。在使用玻璃器皿的情况下,请干热灭菌,或在0.1% DEPC溶液中,37℃下浸泡12h,再高温高压湿热灭菌(121℃,30分钟)。
五、操作流程
1.磁珠预处理
(1)将磁珠悬液漩涡振荡30 s,使磁珠充分重悬;
(2)取出100 μL磁珠悬液至1.5 mL EP管中;磁分离,移去上清液,从磁分离器上取下反应管;
(3)加入1mL结合缓冲液重悬磁珠,用移液器缓慢吹打5~10次或漩涡震荡30 s,磁分离,去上清。
(4)加入100 μL结合缓冲液重悬磁珠。
2.样品前处理
对应样品 |
样品量 |
磁珠量 |
动物组织 |
~50 mg |
100μL |
植物组织 |
~100 mg |
100μL |
培养细胞 |
~1×107 |
100μL |
总RNA |
~100μg |
100μL |
(1)动物/植物组织
a. 将所需量的植物或动物组织在液氮中研磨成粉末,保持冷冻状态,避免RNA降解。
b. 将一定量(参考样品对照表)冷冻粉收集并转移到新的EP管中,添加1mL裂解/结合缓冲液,匀浆器匀浆1-2min至裂解完全。该步骤尽量快速操作,避免mRNA降解。
c. 在室温下以14,000rpm离心1 min,并将所有上清液转移至一个新的EP管。上清液可用于mRNA纯化,或保存在-80℃备用。
(2)细胞悬浮液
a. PBS缓冲液中清洗细胞,室温下以4,000rpm离心5min沉淀细胞并丢弃上清液。
b. 每1-4×106个动物或植物细胞加1ml裂解/结合缓冲液。通过移液吹打多次裂解细胞至溶液变粘稠。
c. 通过DNA剪切降低粘度。用1-2注射器通过21#针头三次吸入和吸出剪切裂解液中的DNA来降低溶液粘度。可能会产生泡沫,但不影响mRNA的得率。
d. 在室温下以14,000rpm离心5min,并将所有上清液转移至一个新鲜的EP管。上清液可进行mRNA纯化,或保存在-80℃以备将来使用。
3.提取mRNA
a. 制备动物/植物组织裂解液或从培养细胞和细胞悬浮液中制备裂解液。
b. 对磁珠进行预处理。
c. 将裂解液与磁珠混合(参考样品对照表),室温下旋转混合3-5分钟。
d. 磁分离,静置2min,去上清。
e. 室温下分别用1ml洗涤液A和1ml洗涤液B清洗磁珠,去除可能的污染物。
f. 进入如下之一操作:
如果分离mRNA用于酶促下游应用(例如固相cDNA合成),洗涤液B(500μL)洗涤一次,随后用酶缓冲液洗涤一次,可用于下游应用。
如从磁珠中洗脱mRNA,洗涤液B洗涤后并加入10~20μl的10mMTris-HCl,75~80°C孵育2min,然后快速将含mRNA的上清转移到新RNase-free的EP管。
4. Total RNA中纯化mRNA
(以纯化75ug Total RNA中mRNA为例)
a. 取100uL含有75ug Total RNA 与100uL结合缓冲液混合。(若Total RNA含量低于75ug/100uL,直接混合;若Total RNA含量高于75ug/100uL,用DEPC水稀释至75ug/100uL后混合)
b. 65°C孵育2min,打开RNA二级结构,结束后迅速置于冰上。
c. 将200 uL混合液与100 uL洗涤后磁珠在室温下旋转混合3-5min。75ug Total RNA对应1mg磁珠,磁珠应预先洗涤并重分散在100 uL结合缓冲液中。
d. 磁分离,静置2min,去上清。
e. 室温下分别用200 uL洗涤液B清洗磁珠,磁分离,去上清。重复该步骤1次。
f. 加入10~20μl 的10mM Tris-HCl,75~80°C孵育2min,然后快速将含有mRNA的上清液转移到新的RNase-free的EP管。
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