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伊势久生物 线粒体活性氧产生速率(ROS)检测试剂盒(荧光法 100T/96S) 科研专用

价格 650/盒
起订量 ≥1
所在地 上海 上海 可售量 10000盒

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基本参数

纯度 / 规格 100T/96S
品牌 伊势久 产品名称 线粒体活性氧产生速率(ROS)检测试剂盒(荧光法 100T/96S)
名称 线粒体活性氧产生速率(ROS)检测试剂盒(荧光法 100T/96S) 货号 AO036
包装类型 测定原理 将荧光强度随时间变化的数据点拟合,线性回归直线斜率与ROS产生的速率呈正比
用途范围 生化研究 类别 生化试剂盒

线粒体活性氧产生速率(ROS)检测试剂盒说明书

荧光法100T/96S

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

活性氧(Reactive oxygen species, ROS)包括超氧自由基、过氧化氢、及其下游产物过氧化物和羟化物等,研究表明,机体95%以上的活性氧(ROS)都来自于线粒体,其失衡所致的氧化应激与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程有关。

正常情况下,细胞内抗氧化防御系统与氧自由基处于平衡状态,细胞内活性氧(ROS)水平维持在较低的生理范围;在病理情况下,细胞内抗氧化系统与氧自由基的平衡被打破,细胞内活性氧水平过多,就可破坏线粒体酶类、脂类和核酸,使机体出现氧化应激,同时,活性氧还可攻击线粒体DNA产生氧化损伤,导致线粒体ATP合成减少、线粒体膜电位破坏等结构和功能变化。

因此,通过检测活性氧的变化来判断线粒体的功能是否正常具有重要意义。

测定原理:

荧光探针-还原型二氯荧光素 (2", 7"-dichlorodihy drofluorescin diacetate, DCFH-DA)可扩散通过线粒体膜,在线粒体内被酯酶水解,形成无荧光的DCFHDCFH迅速与ROS反应生成荧光物氧化型二氯荧光素(2", 7"-dichlo rofluorescin, DCF)。 根据上述原理设计了利用荧光法直接定量检测线粒体ROS产生速率的方法。将荧光强度随时间变化的数据点拟合,线性回归直线斜率与ROS产生的速率呈正比。

组成:

产品名称

AO036-100T/96S

Storage

试剂一:液体

120ml

4℃

试剂液体

50ml

4℃

试剂液体

1.5ml

-20℃

试剂粉剂

1

4℃

试剂粉剂

1

4℃

试剂粉剂

1

4℃

试剂液体

1

-20℃避光

说明书

一份

试剂四:粉剂×1瓶,4℃保存;临用前加入6 ml试剂二充分溶解;

试剂五:粉剂×1瓶,4℃保存;临用前加入6 ml试剂二充分溶解;

试剂六:粉剂×1瓶,4℃保存;临用前加入6 ml试剂二充分溶解;

试剂七:液体×1, 保存;临用前用试剂二稀释300倍后使用;

自备仪器和用品:

多功能酶标仪、恒温培养箱、分析天平、可调式移液器、冰、蒸馏水。

线粒体提取:

1、准确称取0.1g组织或收集500万细胞,加入1ml试剂一和10μl试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2、将上述匀浆液于600g(离心率),4℃离心5min

3、弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g4℃离心10min

4、弃上清,沉淀中加入200μl试剂二重悬。

测定步骤:

1、多功能酶标仪预热30min以上,调节激发光499nm,发射光521nm

2. 在黑色不透光96孔板中加入下列试剂

试剂名称(μl

测定管

空白管

线粒体悬液

20

试剂二

20

试剂四

50

50

试剂五

50

50

试剂六

50

50

试剂七

30

30

混匀,37℃避光孵育15min

孵育完成后,在37℃恒温下测定10min内荧光强度,激发波长499nm,发射波长521nm,记录10min内的荧光值变化。

ROS产生速率计算:

对采样数据点即荧光强度随时间的变化进行线性回归拟合处理 ,计算出回归系数,即直线斜率(k)。实际线粒体ROS产生速率等于样本荧光强度随时间变化的数据点线性回归直线斜率(k测定)减去本底荧光强度随时间变的数据点线性回归直线斜率(k空白)。

(1)按样本鲜重计算:每g组织线粒体每秒钟荧光单位的变化,u/ s/g 鲜重

ROS产生速率(u/ s/g鲜重)=(k测定-k空白)/(V÷V×W=10×(k测定-k空白)÷W

(2)按样本蛋白浓度计算:每毫克蛋白线粒体每秒钟荧光单位的变化u/ s/mg prot

ROS产生速率(u/ s/ mg prot)=(k测定-k空白)/(V÷V×Cpr=10×(k测定-k空白)÷Cpr

V样:加入样本体积,0.02 mlV样总:悬液体积,0.2 mlW: 样本鲜重,gCpr: 样本蛋白浓度,mg/ml

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