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生化试剂甲基柠檬酸合酶（MCS）检测试剂盒（分光光度25T/24S）

价格	￥1800/盒
起订量	≥1
所在地	上海上海	可售量 10000盒

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基本参数

纯度	/	规格	KC012-25T/24S
品牌	伊势久	产品名称	生化试剂甲基柠檬酸合酶（MCS）检测试剂盒（分光光度25T/24S）
名称	生化试剂甲基柠檬酸合酶（MCS）检测试剂盒（分光光度25T/24S）

甲基柠檬酸合酶（metheyl-citrate synthase，MCS）试剂盒说明书

分光光度法

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

MCS广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体基质中，与柠檬酸合酶（CS）共同参与三羧酸循环的调节。

测定原理：

MCS催化丙酰CoA和草酰乙酸产生甲基柠檬酰辅酶A，进一步水解产生甲基柠檬酸；该反应促使无色的DTNB转变成黄色的TNB，在 412nm处有特征吸光值。

组成：

产品名称	KC012-10T/9S	KC012-25T/24S	KC012-50T/48S	Storage
试剂一：液体	10ml	25ml	50ml	-20℃
试剂二：液体	2ml	5ml	10ml	-20℃
试剂三：液体	0.2ml	0.5ml	1ml	-20℃
试剂四：液体	10ml	25ml	50ml	4℃
试剂五：粉剂	1支	1支	2支	4℃
试剂六：粉剂	1支	2支	4支	-20℃
试剂七：粉剂	1支	1支	2支	-20℃
说明书	一份

KC012-10T/9S：试剂五：粉剂×1支，4℃保存，临用前加入320μl无水乙醇；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

试剂六：粉剂×1支，-20℃保存，临用前加入320μl蒸馏水；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

试剂七：粉剂×1支，-20℃保存，临用前加入320μl蒸馏水；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

组织、或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

①称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1ml试剂一和10μl 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

②将匀浆600g，4℃离心5min。

③弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。

④上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的CS（此步可选做）。

⑤在步骤④中的沉淀中加入200μl试剂二和2μl 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3秒，间隔10秒，重复30次），用于线粒体CS测定。

KC012-25T/24S：试剂五：粉剂×1支，4℃保存，临用前加入800μl无水乙醇；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂六：粉剂×2支，-20℃保存，临用前加入400μl蒸馏水；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂七：粉剂×1支，-20℃保存，临用前加入800μl蒸馏水；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

KC012-50T/48S：试剂五：粉剂×2支，4℃保存，临用前加入800μl无水乙醇；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂六：粉剂×4支，-20℃保存，临用前加入400μl蒸馏水；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂七：粉剂×2支，-20℃保存，临用前加入800μl蒸馏水；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

自备仪器和用品：

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1ml玻璃比色皿、研钵、冰、无水乙醇和蒸馏水

样本的前处理：

组织、或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

⑥称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1ml试剂一和10μl 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

⑦将匀浆600g，4℃离心5min。

⑧弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。

⑨上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的CS（此步可选做）。

⑩在步骤④中的沉淀中加入200μl试剂二和2μl 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3秒，间隔10秒，重复30次），用于线粒体CS测定。

测定步骤：

1、分光光度计预热30min以上，调节波长至412nm，蒸馏水调零。

2、将试剂四、五、六和七在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min。

3、样本测定

试剂名称（μl）	测定管
试剂四	780
试剂五	30
试剂六	30
样本	30
试剂七	30

将上述试剂按顺序加入1 ml玻璃比色皿中，加试剂七的同时开始计时，在412nm波长下记录20秒时的初始吸光度A1和反应2min后的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。

MCS活性计算：

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。

MCS（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V样×Cpr) ÷T=1100×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。

MCS（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V样÷V样总）÷T=222.2×ΔA÷W

（3）按或细胞密度计算：

单位的定义：每1万个或细胞每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。

MCS（nmol/min/10⁴cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V样÷V样总）÷T=0.4444×ΔA

V反总：反应体系总体积，9×10^-4L；ε：TNB摩尔消光系数，1.36×10⁴L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.03 ml；V样总：加入提取液体积，0.202 ml；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细胞或总数，500万。