生化试剂叶绿体复合体Ⅴ检测试剂盒(微量法100T/48S)
价格 | ¥2600.00/盒 | |
起订量 | ≥1 | |
所在地 | 上海 上海 | 可售量 10000盒 |
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主营产品: 实验试剂,
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进入店铺基本参数
纯度 | / | 规格 | OP028-100T/48S |
品牌 | 伊势久 | 产品名称 | 生化试剂叶绿体复合体Ⅴ检测试剂盒(微量法100T/48S) |
名称 | 生化试剂叶绿体复合体Ⅴ检测试剂盒(微量法100T/48S) |
叶绿体复合体Ⅴ试剂盒说明书
微量法 100管/48样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
叶绿体复合体Ⅴ又称F1F0-ATP合酶。该酶利用呼吸链产生的质子电化学梯度催化ATP合成,也可逆过程水解ATP。复合体Ⅴ是线粒体氧化磷酸化和叶绿体光合磷酸化合成ATP的关键酶。
测定原理:
复合体Ⅴ水解ATP产生ADP和Pi,通过测定Pi增加速率来测定复合体Ⅴ活性。
试剂的组成和配制:
产品名称
|
OP028-100T/48S
|
Storage
|
试剂一:液体
|
100ml
|
-20℃
|
试剂二:粉剂
|
1支
|
-20℃
|
试剂三:液体
|
8ml
|
4℃
|
试剂四:粉剂
|
1瓶
|
4℃
|
试剂五:粉剂
|
1瓶
|
4℃
|
试剂六:粉剂
|
1瓶
|
4℃
|
试剂七:液体
|
10ml
|
室温
|
说明书
|
一份
|
试剂二:粉剂×1支,-20℃保存;临用前加入2ml蒸馏水,充分溶解备用,用不完的试剂仍-20℃保存;
试剂四:粉剂×1瓶,4℃保存;临用前加入4ml蒸馏水,充分混匀;溶解后4℃保存一周;
试剂五:粉剂×1瓶, 4℃保存;临用前加入10ml蒸馏水,充分混匀;溶解后4℃保存一周;
试剂六:粉剂×1瓶, 4℃保存;临用前加入10ml蒸馏水,充分混匀;溶解后4℃保存一周;
定磷试剂的配制:按H2O: 试剂五:试剂六:试剂七=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷试剂应为浅黄色。若无色则试剂失效,若是蓝色则为磷污染(请根据需要,用多少配多少)。
注意:配试剂最好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器,或者一次性塑料器皿,以避免磷污染。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
叶绿体的提取:
1、称取约0.1g组织或收集500万细胞,加入1ml试剂一,用冰浴匀浆器或研钵匀浆,很快研磨或捣碎,30秒内完成,使之成为匀浆液。
2、将匀浆液于200g(离心率),4℃离心1min。
3、弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,1500g,4℃离心5min。
4、弃上清液,于沉淀中加入0.5ml试剂一混匀配成叶绿体悬浮液。混匀后测定叶绿体酶活性。
测定步骤:
1、酶促反应(在EP管中加入下列试剂)
试剂名称(μl)
|
对照管
|
测定管
|
试剂二
|
10
|
10
|
试剂三
|
40
|
40
|
样本
|
|
50
|
混匀, 37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)准确水浴30min:
试剂四
|
20
|
20
|
样本
|
50
|
|
混匀,4000g,25℃离心10min,取上清液
2、定磷(在EP管或96孔板中加入下列试剂)
上清液
|
30
|
30
|
定磷试剂
|
170
|
170
|
混匀,室温静置10min后,在 660nm处读取A测定管和A对照管,计算ΔA=A测定管-A对照管。每个测定管设一个对照管。
复合体Ⅴ活性计算:
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下:
标准条件下测定的回归方程为y = 1.274x + 0.004;x为标准品浓度(mmol/L),y为A值。
1、组织中复合体Ⅴ活性的计算:
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反总×106]÷(V样×Cpr) ÷T =62.8× (ΔA-0.004) ÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
(2) 按样本鲜重计算
单位的定义:每g组织每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性(nmol/min /g 鲜重)=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反总×106]÷(W× V样÷V样总) ÷T =31.37× (ΔA-0.004) ÷W
(3) 按或细胞密度计算
单位的定义:每1万个或细胞每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性(nmol/min /104 cell)=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反总×106]÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.063× (ΔA-0.004)
V反总:反应体系总体积,1.2×10-4 L; V样:加入样本体积,0.05 mL;V样总:加入提取液体积,0.5 ml;T:反应时间,30 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/ml;W:样本质量,g;500:细胞或总数,500万。
b.使用96孔板测定的计算公式如下:
标准条件下测定的回归方程为y = 0.637x + 0.004;x为标准品浓度(mmol/L),y为A值。
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性(nmol/min /mg prot)=[(ΔA-0.004) ÷0.637×V反总×106]÷(V样×Cpr) ÷T=125.6× (ΔA-0.004) ÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
(2) 按样本鲜重计算
单位的定义:每g组织每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性(nmol/min /g 鲜重)=[(ΔA-0.004)÷0.637×V反总×106]÷(W× V样÷V样总) ÷T=62.74× (ΔA-0.004) ÷W
(3) 按或细胞密度计算
单位的定义:每1万个或细胞每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性(nmol/min /104 cell)=[(ΔA-0.004)÷0.637×V反总×106]÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.126× (ΔA-0.004)
V反总:反应体系总体积,1.2×10-4 L; V样:加入样本体积,0.05 mL;V样总:加入提取液体积,0.5 ml;T:反应时间,30 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/ml;W:样本质量,g;500:细胞或总数,500万。
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