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生化试剂叶绿体复合体Ⅴ检测试剂盒(微量法100T/48S)

价格 2600.00/盒
起订量 ≥1
所在地 上海 上海 可售量 10000盒

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基本参数

纯度 / 规格 OP028-100T/48S
品牌 伊势久 产品名称 生化试剂叶绿体复合体Ⅴ检测试剂盒(微量法100T/48S)
名称 生化试剂叶绿体复合体Ⅴ检测试剂盒(微量法100T/48S)


叶绿体复合体试剂盒说明书

微量法 100/48

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

叶绿体复合体又称F1F0-ATP合酶。该酶利用呼吸链产生的质子电化学梯度催化ATP合成,也可逆过程水解ATP。复合体是线粒体氧化磷酸化和叶绿体光合磷酸化合成ATP的关键酶。

测定原理:

复合体水解ATP产生ADPPi,通过测定Pi增加速率来测定复合体活性。

试剂的组成和配制:

产品名称

OP028-100T/48S

Storage

试剂一:液体

100ml

-20℃

试剂二:粉剂

1

-20

试剂三:液体

8ml

4

试剂:粉剂

1

4℃

试剂五:粉剂

1

4℃

试剂粉剂

1

4℃

试剂:液体

10ml

室温

说明书

一份

试剂二:粉剂×1支,-20℃保存;临用前加入2ml蒸馏水,充分溶解备用,用不完的试剂仍-20℃保存;

试剂四:粉剂×1瓶,4℃保存;临用前加入4ml蒸馏水,充分混匀;溶解后4℃保存一周;

试剂五:粉剂×1, 4℃保存;临用前加入10ml蒸馏水,充分混匀;溶解后4℃保存一周;

试剂六:粉剂×1, 4℃保存;临用前加入10ml蒸馏水,充分混匀;溶解后4℃保存一周;

定磷试剂的配制:按H2O: 试剂五:试剂六:试剂七=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷试剂应为浅黄色。若无色则试剂失效,若是蓝色则为磷污染(请根据需要,用多少配多少)。

注意:配试剂最好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器,或者一次性塑料器皿,以避免磷污染。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

叶绿体的提取:

1、称取约0.1g组织或收集500万细胞,加入1ml试剂一,用冰浴匀浆器或研钵匀浆,很快研磨或捣碎,30秒内完成,使之成为匀浆液。

2、将匀浆液于200g(离心率),4℃离心1min

3、弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,1500g4℃离心5min

4、弃上清液,于沉淀中加入0.5ml试剂一混匀配成叶绿体悬浮液。混匀后测定叶绿体酶活性。

测定步骤:

1、酶促反应(在EP管中加入下列试剂)

试剂名称(μl

对照管

测定管

试剂二

10

10

试剂三

40

40

样本

50

混匀, 37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)准确水浴30min

试剂四

20

20

样本

50

混匀,4000g25℃离心10min,取上清液

2、定磷(EP管或96孔板中加入下列试剂)

上清液

30

30

定磷试剂

170

170

混匀,室温静置10min后,在 660nm处读取A测定管和A对照管,计算ΔA=A测定管-A对照管。每个测定管设一个对照管。

复合体活性计算:

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下:

标准条件下测定的回归方程为y = 1.274x + 0.004x为标准品浓度(mmol/L),yA值。

1、组织中复合体活性的计算:

1) 按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。

复合体活性(nmol/min/mg prot=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反总×106]÷(V×Cpr) ÷T =62.8× (ΔA-0.004) ÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

2) 按样本鲜重计算

单位的定义:每g组织每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。

复合体活性(nmol/min /g 鲜重)=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反总×106]÷(W× V÷V样总) ÷T =31.37× (ΔA-0.004) ÷W

3) 按或细胞密度计算

单位的定义:每1万个或细胞每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。

复合体活性(nmol/min /104 cell=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反总×106]÷(500×V÷V样总) ÷T=0.063× (ΔA-0.004)

V反总:反应体系总体积,1.2×10-4 LV样:加入样本体积,0.05 mLV样总:加入提取液体积,0.5 mlT:反应时间,30 minCpr:样本蛋白质浓度,mg/mlW:样本质量,g500:细胞或总数,500万。

b.使用96孔板测定的计算公式如下:

标准条件下测定的回归方程为y = 0.637x + 0.004x为标准品浓度(mmol/L),yA值。

1) 按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。

复合体活性(nmol/min /mg prot=[(ΔA-0.004) ÷0.637×V反总×106]÷(V×Cpr) ÷T=125.6× (ΔA-0.004) ÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

2) 按样本鲜重计算

单位的定义:每g组织每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。

复合体活性(nmol/min /g 鲜重)=[(ΔA-0.004)÷0.637×V反总×106]÷(W× V÷V样总) ÷T=62.74× (ΔA-0.004) ÷W

3) 按或细胞密度计算

单位的定义:每1万个或细胞每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。

复合体活性(nmol/min /104 cell=[(ΔA-0.004)÷0.637×V反总×106]÷(500×V÷V样总) ÷T=0.126× (ΔA-0.004)

V反总:反应体系总体积,1.2×10-4 LV样:加入样本体积,0.05 mLV样总:加入提取液体积,0.5 mlT:反应时间,30 minCpr:样本蛋白质浓度,mg/mlW:样本质量,g500:细胞或总数,500万。

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