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生化试剂乙酰辅酶A羧化酶(ACC)检测试剂盒(微量法 100T/48S)

价格 1700.00/盒
起订量 ≥1
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基本参数

纯度 1 规格 FA001-100T/48S
品牌 伊势久 产品名称 生化试剂乙酰辅酶A羧化酶(ACC)检测试剂盒(微量法 100T/48S)
名称 生化试剂乙酰辅酶A羧化酶(ACC)检测试剂盒(微量法 100T/48S)


乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl-CoA carboxylaseACC)试剂盒说明书

微量法 100/48

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

ACC在生物体内催化乙酰辅酶A羧化生成丙二酰辅酶A,是脂肪酸和许多次生代谢产物合成的关键酶。ACC的活性在一定程度上决定了脂肪酸的合成速度和含油量的高低。

测定原理:

ACC能够催化乙酰辅酶ANaHCO3ATP生成丙二酰辅酶AATP和无机磷,通过钼酸铵定磷法测定无机磷的增加量来测定ACC活性。

组成:

产品名称

FA001-100T/48S

Storage

提取液:液体

100ml

4℃

试剂一:液体

10ml

4℃

试剂二:粉剂

1

4℃

试剂三:粉剂

1

-20

试剂:粉剂

1

4℃

试剂五:粉剂

1

4℃

试剂:液体

25ml

室温

试剂:液体

10ml

4℃

说明书

一份

试剂四:粉剂×1 , 4℃保存。用时加入25ml蒸馏水,溶解后4℃可保存一周。

试剂五:粉剂×1, 4℃保存。用时加入25ml蒸馏水,溶解后4℃可保存一周。

试剂七:10μmol/ml标准磷贮备液 10ml×1 瓶,4℃保存。

自备仪器和用品:

分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

样本的前处理:

1、或培养细胞:先收集或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照或细胞数量(104个):提取液体积(ml)为500~10001的比例(建议500万或细胞加入1ml提取液),超声波破碎或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(ml)15~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1ml提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

测定步骤:

1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至660nm,蒸馏水调零。

2、酶促反应试剂的配制和预热:在试剂二瓶中加入2.5ml试剂一,充分溶解混匀;在试剂三瓶中加入2ml蒸馏水,充分溶解混匀;将试剂一、二、三在37℃(哺乳动物)25℃(其它物种)预热10分钟。

3、定磷试剂的配制:按H2O: 试剂四:试剂五:试剂六=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷试剂

应为浅黄色,若无色则试剂失效,若是蓝色则为磷污染,定磷剂现用现配。

注意:配试剂最好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器,也可以用一次性塑料器皿,避免磷污染。

40.5μmol/ml标准磷应用液配制:将试剂七20倍稀释,即取 0.5ml试剂七加9.5蒸馏水,充分混匀。

5、酶促反应

试剂名称(μL

对照管

测定管

试剂一

90

试剂二

50

试剂三

40

样本

10

10

37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)准确反应30min后,90℃水浴5min(盖紧,以防止水分散失),冷却后,10000g 25℃离心5min,取上清

6、定磷

标准管

空白管

对照管

测定管

0.5μmol/ml标准磷应用液

20

蒸馏水

20

上清液

20

20

定磷试剂

180

180

180

180

混匀,37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)保温30min,冷却至室温,在 660nm处,蒸馏水调零,记录各管吸光值A。标准管、空白管只要做一次即可,每个测定管需要设一个对照管。

注意:若测定管吸光值大于2,将样品用提取液稀释适当倍数后再进行测定,使吸光值小于2,可提高检测灵敏度,计算公式中乘以相应稀释倍数。

ACC活性计算:

1、按组织蛋白浓度计算:

定义:每小时每毫克组织蛋白产生1μmol无机磷的量为一个 ACC活力单位。

ACC (μmol/h/mg prot)=(C标准管×V)×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管

(V×Cpr)÷T=10×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷Cpr

2、按样本鲜重计算:

定义:每小时每g组织产生1μmol无机磷的量为一个 ACC活力单位。

ACC (μmol/h /g鲜重)=(C标准管×V)×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V÷

(W× V÷V样总)÷T=10×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷W

3、按或细胞密度计算:

定义:每小时每500万或细胞产生1μmol无机磷的量为一个 ACC活力单位。

ACC (U/104cell)=(C标准管×V)×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V÷

(500× V÷V样总)÷T=0.02×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)

C标准管:标准管浓度,0.5μmol/mlV总:酶促反应总体积,0.1mlV样:加入样本体积,0.01mlV样总:加入提取液体积,1mlT:反应时间,0.5小时;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mlW:样本鲜重,g500:或细胞总数,500万。

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