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伊势久生物 中性蛋白酶测定试剂盒 分光光度法 50T/24S微量法 50T/24S 科研专用

价格 580/盒
起订量 ≥1
所在地 上海 上海 可售量 10000盒

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基本参数

纯度 / 规格 50T/24S
品牌 伊势久 产品名称 生化试剂中性蛋白酶测定试剂盒 分光光度法 50T/24S
名称 生化试剂中性蛋白酶测定试剂盒 分光光度法 50T/24S 货号 PI003
包装类型 测定原理 在碱性条件下,酪氨酸还原磷钼酸化合物生成钨蓝;在680nm有特征吸收峰。
用途范围 生化研究 类别 生化试剂盒

中性蛋白酶(Neutral protease, NP)活性测定试剂盒说明书

分光光度法 50/24

注意:正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

NP在一定的温度和中性pH条件下,催化水解蛋白质。由于其安全无毒、水解能力强、作用范围广等特点,中性蛋白酶常用于食品、饲料、化妆品和营养保健品生产。

测定原理:

中性条件下,NP催化酪蛋白水解产生酪氨酸;在碱性条件下,酪氨酸还原磷钼酸化合物生成钨蓝;在680nm有特征吸收峰。

组成:

产品名称

PI003-50T/24S

Storage

试剂一:液体

90ml

4℃

试剂二:粉剂

1

4℃

试剂三:粉剂

1

4℃避光

试剂:粉剂

1

4℃

试剂五:液体

10ml

4℃

标准品:液体

1ml

4℃

说明书

一份

试剂二:粉剂×1瓶,4℃保存。临用前加10 ml蒸馏水溶解。

试剂三:粉剂×1瓶,4℃避光保存。临用前加入20 ml试剂一,沸水浴中磁力搅拌溶解。(可在烧杯上盖一层保鲜膜,注意观察,避免水分全部蒸发,一般加热15-30分钟,该试剂为过饱和试剂,充分混匀后仍出现颗粒物不溶物不影响使用)。

试剂四:粉剂×1瓶, 4℃保存。临用前加50 ml蒸馏水溶解。

标准品:液体1ml×1支,0.25 μ mol/ml标准酪氨酸溶液,4℃保存。

自备仪器和用品:

可见分光光度计、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、1ml玻璃比色皿、1.5 ml EP管和蒸馏水。

粗酶液提取:

1组织:按照组织质量(g):试剂一体积(ml)15~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1ml试剂一)冰浴匀浆,8000g4℃离心10min,取上清,即粗酶液。

2血清或培养液:直接测定。

3细菌、真菌:按照细胞数量(104个):试剂一体积(ml)为500~10001的比例(建议500万细胞加入1ml试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后8000g4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。

测定操作:

1.分光光度计预热30min,调节波长到680 nm,蒸馏水调零。

2.试剂二、试剂三和试剂四置于30℃水浴保温30min

3. 对照管:取一支EP管,加入100μl粗酶液,200μl试剂二,混匀后置于30℃水浴保温10min;加入200μl试剂三,混匀后8000g4℃离心10min;取200μl上清液,加入新的EP管,再加入1000μl试剂四,200μl试剂五,混匀后置于30℃水浴保温20min,于680nm测定光吸收,记为A对照管。

4. 测定管:取一支EP管,加入100μl粗酶液,200μl试剂三,混匀后置于30℃水浴保温10min;加入200μl试剂二,混匀后8000g4℃离心10min;取200μl上清液,加入新的EP管,再加入1000μl试剂四,200μl试剂五,混匀后置于30℃水浴保温20min,于680nm测定光吸收,记为A测定管。(注意与空白管不同,先加试剂三,后加试剂二)

5. 空白管:EP管,加入200μl蒸馏水,1000μl试剂四,200μl试剂五,混匀后置于30℃水浴保温20min,于680nm测定光吸收,记为A空白管。

6. 标准管:EP管,加入200μl标准品,1000μl试剂四,200μl试剂五,混匀后置于30℃水浴保温20min,于680nm测定光吸收,记为A标准管。

注意:空白管和标准管只需要测定一次。

计算公式:

1. 按照样本蛋白浓度计算

NP活性单位定义:30℃每毫克蛋白每分钟水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。

NP活性(nmol/min /mg prot= C标准品×A测定管-A对照管)÷A标准管-A空白管)×V反总÷(Cpr×V1)÷T= 125×A测定管-A对照管)÷A标准管-A空白管)÷Cpr

2.按照样本质量计算

NP活性单位定义:30℃每克样品每分钟催化水解产生1 nmol酪氨酸为1个酶活单位。

NP活性(nmol/min /g鲜重)=C标准品×A测定管-A对照管)÷A标准管-A空白管)×V反总÷W×V1÷V2÷T= 125×A测定管-A对照管)÷A标准管-A空白管)÷W

3. 按照液体体积计算

NP活性单位定义:30℃每毫升样品每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。

NP活性(nmol/min/ml=C标准品×A测定管-A对照管)÷A标准管-A空白管)×V反总÷V1÷T= 125×A测定管-A对照管)÷A标准管-A空白管)

按照细胞数量计算

NP活性单位定义:30℃104个细胞每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。

NP活性(nmol/min /104cell=C标准品×A测定管-A对照管)÷A标准管-A空白管)×V反总÷(细胞数量×V1÷V2÷T= 125×A测定管-A对照管)÷A标准管-A空白管)÷细胞数量

C标准品:0.25 μ mol/ml标准酪氨酸溶液;V反总:酶促反应总体积,0.5mlCpr:粗酶液蛋白质浓度(mg/ml);V1:加入反应体系中粗酶液体积(ml),0.1 mlV2:提取液总体积(ml),1mlT:催化反应时间(min),10minW:样品质量(g)。

注意事项:

临用前配制的试剂配制好后4℃保存,并且3天内使用完毕。

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