快速内切酶EcoRV 快速限制性内切酶
| 价格 | ￥240.00/袋 | |
| 起订量 | ≥1 | |
| 所在地 | 上海 上海 | 可售量 10000袋 |
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上海跃腾生物技术有限公司
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快速内切酶EcoRV
REF: MD043
5'...G A T A T C...3'
3'...C T A T A G...5'
同裂酶：Eco32I
注：同裂酶对于不同的甲基化修饰也许具有不同敏感性。
建议反应条件
1× Reaction缓冲液；
37℃温育；
参照“DNA 快速酶切流程”配制反应体系。
失活条件：80℃ 温育 20 min。
产品组成
组分 / 规格
|
MD043-200Rxns
|
Storage
|
快速内切酶EcoRV
|
200 μl
|
-20℃
|
10× ReactionBuffer
|
1 ml
|
-20℃
|
10× ReactionColor Buffer
|
1 ml
|
-20℃
|
产品说明
快速内切酶是一系列经过基因工程重组、能够在 5~15 分钟内精确完成 DNA 切割的限制性内切酶，适用于质粒DNA、PCR 产物或基因组 DNA 等的快速酶切。快速内切酶 快速内切酶具有如下特点：5~15 分钟内即可完成酶切；共用一种酶切 Buffer，大大简化酶切反应体系；良好的酶活冗余度，轻松应对底物过量或困难模板酶切。此外，伊势久去磷酸化、连接试剂在 Reaction酶切 Buffer 中具有 100% 活性，支持一管化反应，提升“酶切—修饰—连接”的体验。
使用方法
1. DNA 快速酶切流程
①冰上按照下表配制反应体系：
质粒DNA
|
PCR 产物
|
基因组DNA
|
|
ddH2O
|
15μl
|
16μl
|
30μl
|
10× ReactionBuffer 或 10× ReactionColor Buffer
|
2μl
|
3 μla
|
5μl
|
底物 DNA
|
2 μl(up to 1 μg)
|
10 μl(~0.2 μg)
|
10 μl(5 μg)
|
快速内切酶 EcoRV
|
1μl
|
1μl
|
5μl
|
Total
|
20μl
|
30μl
|
50μl
|
a. 本体系适用于经过纯化的PCR 产物酶切。未纯化的PCR 产物具备一定的离子强度，10× ReactionBuffer 加入量可适当减少至2μl。但由于DNA 聚合酶同时具有外切酶活性，会影响酶切产物，因此如下一步需进行克隆等操作，建议酶切前对PCR 产物进行纯化。
② 轻柔吸打或轻弹管壁以混匀（切勿涡旋），然后瞬时离心以收集挂壁液滴；
③ 37℃温育 15 min（质粒），或 15~30 min（PCR 产物），或 30~60 min（基因组 DNA）；
④ 80℃温育 20 min 即可使酶失活，停止反应（可选）。
2. 双酶切或多酶切
① 每种快速内切酶的用量为 1 μl，并根据需要适当扩大反应体系；
② 所有快速内切酶的体积总和不得超过总反应体系的 1/10；
③ 如果所用的几种快速内切酶的最适反应温度不同，应先以最适温度低的酶开始酶切，再添加最适温度较高的酶，在其最适反应温度下进行酶切反应。
3. 适用于质粒的扩大反应体系
DNA
|
1 μg
|
2 μg
|
3 μg
|
4 μg
|
5 μg
|
快速内切酶 EcoRV
|
1μl
|
2μl
|
3μl
|
4μl
|
5μl
|
10× ReactionBuffer 或 10× ReactionColor Buffer
|
2μl
|
2μl
|
3μl
|
4μl
|
5μl
|
Total
|
20μl
|
20μl
|
30μl
|
40μl
|
50μl
|
注：如果总反应体系大于 20 μl，应适当增加温育时间，尽量使用水浴、金属浴或沙浴。
质量控制
质控项目
|
质控标准
|
功能活性检测
|
最适反应温度下，在 20 μl反应体系中，1 μl快速内切酶 EcoRV 能够在 15 min内完全消化 1 μgλDNA 。
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星号活性测试
|
最适反应温度下，将1 μl快速内切酶 EcoRV 与1 μgλDNA 共同温育 3 h，未检测到其他核酸酶污染或星号活性引起的底物非特异性降解，延时酶切可能出现星号活性
|
酶切—连接—再酶切检测
|
最适反应温度下，使用 1 μl快速内切酶 EcoRV 消化底物，回收酶切产物。在 22 ℃下使用适量 Fast T4 DNA Ligase 可以将酶切产物重新连接。将连接产物再次回收后，使用相同的内切酶可以重新切开连接产物。
|
非特异性内切酶活性检测
|
最适反应温度下，使用 1 μl快速内切酶EcoRV 与 1 μg超螺旋质粒 DNA 共同温育 4 h，使用琼脂糖凝胶电泳检测，质粒 DNA 仍然处于超螺旋状态。
|
蓝白斑检测
|
将含有单一lacZα 基因的载体以 1 μlEcoRV消化，重新连接后转化入大肠杆菌感受态细胞，涂布在含有对应抗生素、 IPTG 和 X-gal 的 LB 培养基平板上。连接正确的产物会生长出蓝色菌落，而连接错误（即 DNA 末端切口不完整）的产物将得到白色菌落。对于 Reaction系列限制酶而言，白色菌落比例应小于1%。
|
不同 DNA 中的酶切位点数量
λDNA
|
ΦX174
|
pBR322
|
pUC57
|
pUC18/19
|
SV40
|
M13mp18/19
|
Adeno2
|
21
|
0
|
1
|
1
|
0
|
1
|
0
|
9
|
甲基化修饰影响
Dam
|
Dcm
|
CpG
|
EcoKI
|
EcoBI
|
无影响
|
无影响
|
无影响
|
无影响
|
序列可能重叠
剪切可能受影响
|
在不同反应缓冲液中的活性
BIOISCO
|
Thermo Scientific
|
NEB
|
Takara
|
|
ReactionBuffer
|
FastDigest Buffer
|
CutSmart? Buffer
|
QuickCut? Buffer
|
|
活性
|
100%
|
100%
|
100%
|
100%
|
注：活性数据来自 BIOISCO 限制酶标准反应体系下的检测。
上海跃腾生物技术有限公司
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