伊势久生物 抗体染料法定量PCR预混液（无Rox）
| 价格 | ￥864.00/袋 | |
| 起订量 | ≥1 | |
| 所在地 | 上海 上海 | 可售量 100袋 |
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上海跃腾生物技术有限公司
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主营产品： 实验试剂,
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基本参数
| 纯度 | · | 规格 | MP008M-1 ml×5 |
| 品牌 | 伊势久 | 用途范围 | 生化研究 |
| 保质期 | 年 | 产品规格 | 1 ml×5 |
| 产品名称 | 抗体染料法定量PCR预混液（无Rox） | 化学名 | Taq SYBR? Green qPCR Premix(None Rox) |
| 名称 | Taq SYBR? Green qPCR Premix (None/Low/High ROX & | 储运 | -20℃避光 |
Taq SYBR?Green qPCR Premix (None/Low/High ROX Universal)
REF: MP008/MP009/MP010/MP023
储运条件
长期保存请于 -20℃避光保存，Mix 融解后可在4℃避光条件下稳定存放一个月，尽量避免反复冻融。
产品组成
组分/规格
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MP008M
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MP009M
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MP010M
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MP023M
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Taq SYBR?Green qPCR Premix(None ROX)
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5×1ml
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Taq SYBR?Green qPCR Premix(Low ROX)
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5×1ml
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Taq SYBR?Green qPCR Premix(High ROX)
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5×1ml
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Taq SYBR?Green qPCR Premix(Universal)
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5×1ml
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产品简介
Taq SYBR?Green qPCR Premix是SYBR?Green I嵌合染料法专用qPCR试剂，为2×预混液，包含除引物和DNA样品以外的所有qPCR组分，可减少操作步骤，缩短加样时间，降低污染几率。其核心组分是经抗体修饰的热启动Taq DNA聚合酶，配合精心优化的Buffer体系以及PCR反应促进因子，是产品具有特异性强、扩增效率高等特点，有效抑制非特异性扩增，可对宽广浓度范围的模板进行准确定量，获得稳定可靠的qPCR结果。
使用方法
1. 适用机型
产品
|
适用机型
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MP008(None ROX)
|
Bio-Rad CFX 全系列；
Roche LightCycler? 系列；
Eppendorf Mastercycler? ep realplex 系列；
Qiagen/Corbett Rotor-Gene? 系列；
Takara Thermal Cycler Dice；
analytikjena qTOWER系列等
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MP009(Low ROX)
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ABI 7500/7500 Fast，ABI ViiA 7?；
ABI QuantStudio? 系列；
Stratagene Mx3000P?/3005P?/4000?
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MP010(High ROX)
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ABI 7000/7300/7700/7900 HT/7900 HT Fast，StepOne?，StepOne Plus?等
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MP023（Universal）
|
全机型通用
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2.使用注意
① 因 Mix 中预混有染料，其保存或反应体系配制过程应避免强光照射；
② 使用前上下颠倒轻轻混匀 Mix，请勿涡旋振荡混匀，避免产生过多气泡。
3. 建议的qPCR反应体系
试剂
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使用量
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终浓度
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TaqSYBR? Green qPCRPremix
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10μl
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1×
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正向引物 (10 μM)a
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0.4 μl
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0.2 μM
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反向引物 (10 μM)a
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0.4 μl
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0.2 μM
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DNA 模板b
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X μl
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10~200ng/20 μl
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Nuclease-Free Water
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To 20 μl
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a.通常推荐的引物终浓度为0.2uM，反应效果不佳时可0.1~1μM范围内进行调整；
b.推荐模板加样量为1~2μl，如模板类型为未稀释cDNA原液，模板添加量不应超过总反应体系的10%。不同种类DNA模板中含有的靶基因拷贝数目不同，必要时可进行梯度稀释，以确定最佳的DNA模板添加量。
4. qPCR反应程序（可根据机型适当调整）
两步法
步骤
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温度
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时间
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预变形
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95 ℃
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30 sec
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变形
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95 ℃
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10 sec 40 个循环
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退火延伸a
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60℃
|
30 sec
|
熔解曲线b
|
使用仪器默认采集程序
|
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三步法
步骤
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温度
|
时间
|
预变形
|
95 ℃
|
30 sec
|
变形
|
95 ℃
|
10 sec
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退火a
|
55~65 ℃
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10 sec 40 个循环
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延伸a
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72℃
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30 sec
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熔解曲线b
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使用仪器默认采集程序
|
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a.根据引物的Tm值进行退火（退火延伸）温度的设定；若扩增片段在 200 bp以内，延伸（退火延伸）时间可以设置为15 sec；此外，延伸时间的设置还需根据您使用的qPCR仪所需要的数据采集最短时间限制自行调整；
b. 不同qPCR仪的熔解曲线采集程序有差别，一般可使用仪器默认的熔解曲线采集程序。
5.实验优化
若使用默认反应条件反应性能不佳时，则需要进行反应条件的优化，可以从引物浓度以及扩增程序两个方面进行：
①引物浓度调整
当引物终浓度在0.1～1.0μM范围之间变化时，引物浓度越低，扩增特异性越高，但扩增效率会有所下降。
②扩增程序优化
需提高扩增特异性，可使用两步法程序或提高退火温度；需提高扩增效率，可使用三步法程序或延长延伸时间。
6.引物设计原则
① 扩增产物长度建议控制在 80～200 bp
② 引物长度为 18～25 bp；
③ 正向引物和反向引物的Tm 值相差不超过 1 ℃为佳，Tm 值控制在 58～62℃为佳；
④ 引物的 GC 含量控制在 40%～60% 之间；
⑤ 引物 A、G、C、T 整体分布尽量要均匀，避开 T/C 或者 A/G的连续结构（特别是 3'端）；
⑥ 引物 3' 端最后一个碱基最好为 G 或者 C；
⑦ 避开引物内部或者两条引物之间的互补序列；
⑧ 使用 NCBI BLAST 功能检索确认引物的特异性
常见问题
问题描述
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可能原因
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解决办法
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扩增曲线不光滑
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荧光信号太弱，经系统校正后产生
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确保 Mix 中预混的染料未降解；更换荧光信号收集更好的 qPCR 专用耗材
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扩增曲线断裂或下滑
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模板浓度较高，基线的终点值大于 Cq 值
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减小基线终点 (Cq 值 -4)， 重新分析数据
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个别孔扩增曲线突然骤降
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反应管内留有气泡
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确保 Mix 完全溶解，请勿涡旋振荡混匀；加样完成后轻弹离心去除气泡；
延长预变性时间至10 min，以去除气泡
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反应结束无扩增曲线出现
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反应循环数偏少
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设置循环数为40，但更多的循环数会增加过多的背景信号
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荧光信号采集步骤未设置或者设置错误
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两步法扩增程序一般将信号采集设置在退火 延伸阶段，三步法扩增程序应 当将信号采集设置在 72℃延伸阶段
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引物可能降解
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长期未用的引物，应先通过 PAGE 电泳检测完整性，以排除其降解的可能
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模板浓度过低
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减少模板稀释倍数重复实验，样品浓度未知的情况下先从最高浓度做起
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|
模板降解
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重新制备模板，重复实验
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Cq 值出现过晚
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扩增效率低
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提高引物浓度，尝试三步法扩增程序，或者重新设计引物
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模板浓度过低
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减少模板稀释倍数重复实验，样品浓度未知的情况下先从最高浓度做起
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模板降解
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重新制备模板，重复实验
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扩增产物过长
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扩增产物长度控制在 80~200 bp
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体系中存在 PCR 抑制剂
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一般为模板带入，加大模板稀释倍数或重新制备纯度高的模板重复实验
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空白对照出现信号
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反应体系污染
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首先更换空白对照的水，如果还发生同样情况，继续更换引物、吸头、
PCR 管或启用新的 Mix；反应体系在超净工作台内配制，减少气溶胶污染
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出现引物二聚体等非特异性扩增
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一般在分析35 循环以后空白对照出现扩增产物属正常情况，应配合熔解曲线分析；重新设计引物，调整引物浓度或优化 PCR 反应程序
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熔解曲线出现多峰
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引物设计不佳
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根据引物设计原则重新设计新引物
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引物浓度过高
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适当降低引物浓度
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实验重复性差
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加样误差大
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使用精准的移液器、配合高品质吸头准确移液；高倍稀释模板，加入大体积模板减少加样误差；放大qPCR反应体积
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模板浓度过低
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减少模板稀释倍数重复实验
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qPCR 仪不同位置的温度偏差
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定期校准 qPCR 仪
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