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伊势久生物 顺乌头酸酶检测试剂盒 分光光度法 50T/48S 科研专用

价格 580/盒
起订量 ≥1
所在地 上海 上海 可售量 10000盒

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基本参数

纯度 / 规格 50T/48S
品牌 伊势久 产品名称 生化试剂顺乌头酸酶检测试剂盒 分光光度法 50T/48S
名称 生化试剂顺乌头酸酶检测试剂盒 分光光度法 50T/48S 货号 KC018
包装类型 测定原理 ACO催化柠檬酸转化成异柠檬酸,异柠檬酸氧化脱羧将NAD+ 还原生成NADH
用途范围 生化研究 类别 生化试剂盒

顺乌头酸酶(ACO)活性检测试剂盒说明书

分光光度法 50/48

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

顺乌头酸酶(aconitase),三羧酸循环中的酶,催化柠檬酸转变为异柠檬酸。柠檬酸本身不易氧化,在顺乌头酸酶作用下,通过脱水与加水反应,使羟基由β碳原子转移到α碳原子上,生成易于脱氢氧化的异柠檬酸,为进一步的氧化脱羧反应作准备。

测定原理:

ACO催化柠檬酸转化成异柠檬酸,异柠檬酸氧化脱羧将NAD还原生成NADH,导致340nm处光吸收上升。

组成:

产品名称

KC018-50T/48S

Storage

试剂一:液体

50ml

-20℃

试剂二:液体

10ml

-20℃

试剂三:液体

1ml

-20℃

试剂四:液体

60ml

4℃

试剂五:液体

5ml

4℃

试剂六:粉剂

1

-20℃

试剂七:粉剂

1

4℃

说明书

一份

试剂六:粉剂×1支,-20℃保存;临用前加3ml蒸馏水充分溶解;现配现用

试剂七:粉剂×1支,保存;临用前加36ml试剂四充分溶解;

工作液:临用前在36ml试剂七中加入3ml蒸馏水、3ml试剂四、3ml试剂五、3ml试剂六充分混匀

自备仪器和用品:

紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1ml石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

样本的前处理

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:

1、称取约0.1g组织或收集500万细胞,加入1ml试剂一和10μl 试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2、将匀浆转入离心管内600g4℃离心5min

3、弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g4℃离心10min

4、上清液即胞浆提取物,可用于测定胞质顺乌头酸酶活性

5、在步骤的沉淀中加入200μl试剂二和2μl 试剂三,超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3秒,间隔10秒,重复30次),用于线粒体顺乌头酸酶活性测定

测定步骤:

1、分光光度计预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。

2、样本测定

1)将工作液,置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴10min现配现用;若分次用将工作液分装后于-20°保存,一星期内可用。

3)在1ml石英比色皿中加入100μl样本900μl工作液,混匀,立即记录340nm20s时的吸光值A13min20s后的吸光值A2,计算ΔA=A2-A1

ACO活性计算:

用石英比色皿测定的计算公式如下

1) 按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟生成1 nmolNADH定义为一个酶活性单位。

ACO活性(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷ε×d×109]÷(Cpr×V) ÷T=536×ΔA÷Cpr

2) 按样本鲜重计算

单位的定义:每g组织每分钟生成1 nmolNADH定义为一个酶活性单位。

ACOnmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷ε×d×109]÷(W ×V÷V样总) ÷T=108×ΔA÷W

3) 按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmolNADH定义为一个酶活性单位。

ACO活性(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反总÷ε×d×109]÷(500×V÷V样总)÷T=0.722×ΔA

V反总:反应体系总体积,0.001 LεNADH摩尔消光系数,6.22×103L / mol /cmd:比色皿光径,1cmV样:加入样本体积,0.1 mlV样总:加入提取液体积,0.202 mlT:反应时间,3minCpr:样本蛋白质浓度,mg/mlW:样本质量,g500:细菌或细胞总数,500万。

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