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伊势久生物线粒体复合体Ⅴ检测试剂盒分光光度法25T/12S 微量法100T/48S 科研专用

价格	￥1320/盒
起订量	≥1
所在地	上海上海	可售量 10000盒

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基本参数

纯度	/	规格	25T/12S
品牌	伊势久	产品名称	生化试剂线粒体复合体Ⅴ检测试剂盒分光光度法25T/12S
名称	生化试剂线粒体复合体Ⅴ检测试剂盒分光光度法25T/12S	货号	OP016
包装类型	盒	测定原理	复合体Ⅴ水解ATP产生ADP和Pi，通过测定Pi增加速率来测定复合体Ⅴ活性
用途范围	生化研究	类别	生化试剂盒

线粒体复合体Ⅴ试剂盒说明书

分光光度法 25管/12样

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

线粒体复合体Ⅴ又称F₁F₀-ATP合酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，由F1和F0两个亚单位组成。该酶利用呼吸链产生的质子电化学梯度催化ATP合成，也可逆过程水解ATP。此外，复合体Ⅴ还存在于叶绿体、异养菌和光合细菌中。复合体Ⅴ是线粒体氧化磷酸化和叶绿体光合磷酸化合成ATP的关键酶。

测定原理：

复合体Ⅴ水解ATP产生ADP和Pi，通过测定Pi增加速率来测定复合体Ⅴ活性。

试剂的组成和配制

产品名称	OP016-25T/12S	Storage
试剂一：液体	25ml	-20℃
试剂二：液体	25ml	-20℃
试剂三：液体	1ml	-20℃
试剂四：粉剂	1支	-20℃
试剂五：液体	6ml	4℃
试剂六：粉剂	1瓶	4℃
试剂七：粉剂	1瓶	4℃
试剂八：粉剂	1瓶	4℃
试剂九：液体	10ml	室温
说明书	一份

试剂四：粉剂×1支，-20℃保存；临用前每支加入1.3mL蒸馏水，充分溶解备用，用不完

的试剂仍-20℃保存;

试剂六：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入3mL蒸馏水，充分混匀；溶解后4℃保存一周；

试剂七：粉剂×1瓶, 4℃保存；临用前加入10mL蒸馏水，充分混匀；溶解后4℃保存一周；

试剂八：粉剂×1瓶, 4℃保存；临用前加入10mL蒸馏水，充分混匀；溶解后4℃保存一周；

定磷试剂的配制：按H2O: 试剂七:试剂八:试剂九=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷试剂应为浅黄色。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染（请根据需要，用多少配多少）。

注意：配试剂最好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。

需自备的仪器和用品

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

1、准确称取0.1g组织或收集500万细菌或细胞，加入1mL试剂一和10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2、将匀浆600g，4℃离心5min。

3、弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。

4、上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅴ（此步可选做）。

5、步骤4中的沉淀即为线粒体，加入800uL试剂二和8uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10秒，重复30次），用于复合体Ⅴ酶活性测定。

测定步骤：

1、酶促反应

试剂名称（μl）	对照管	测定管
试剂四	25	25
试剂五	100	100
样本		125

混匀， 37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）准确水浴30min

试剂六	50	50
样本	125

混匀，4000g，25℃离心10min，取上清液

2、定磷

上清液	170	170
定磷试剂	830	830

混匀，室温静置10min左右，在660nm处读取A测定管和A对照管，计算ΔA=A测定管-A对照管。

复合体Ⅴ活性计算

标准条件下测定的回归方程为y = 1.274x 0.004；x为标准品浓度（mmol/L），y为A值。

1、组织中复合体Ⅴ活性的计算:

（1）按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。

复合体Ⅴ活性（nmol/min/mg prot）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反总×106]÷(V样×Cpr) ÷T

=62.8× (ΔA-0.004) ÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

（2）按样本鲜重计算

单位的定义：每g组织每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。

复合体Ⅴ活性（nmol/min /g 鲜重）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反总×106]÷(W× V样÷V样总) ÷T =50.7× (ΔA-0.004) ÷W

（3）按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。

复合体Ⅴ活性（nmol/min /104 cell）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反总×106]÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.101× (ΔA-0.004)

V反总：反应体系总体积，3×10-4 L； V样：加入样本体积，0.125 mL；V样总：加入提取液体积，0.808 mL；T：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。

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