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伊势久生物快速DNA组装预混液 20 Rxns 50 Rxns 科研专用

价格	￥618/袋
起订量	≥1
所在地	上海上海	可售量 10000袋

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实验步骤

1.实验流程概要

2.线性化克隆载体制备

选择合适的克隆位点，对载体进行线性化，载体的线性化可以通过酶切或反向 PCR 扩增完成。

① 酶切制备

推荐使用BIOISCO快速内切酶进行双酶切，使载体线性化完全，以降低转化背景 ( 假阳性克隆 )；若使用单酶切进行线性化，可以适当延长酶切时间以减少环状质粒残留。

注 1：经双酶切进行线性化的载体无需去磷酸化，经单酶切则需要去磷酸化；注 2：酶切完成后，应将快速内切酶失活或对目的产物纯化后再用于重组反应。

②反向 PCR 扩增制备

为减少扩增突变的引入，推荐使用高保真 PCR Mix 进行扩增。推荐使用预线性化质粒作为模板，以减少环状质粒模板残留对克隆阳性率的影响。

3.插入片段PCR引物设计

PCR 引物的 5" 端必须包含与其相邻片段（插入片段或载体）末端同源的 15~25 nt（推荐 18 nt）序列。假如载体为粘性末端，且 3" 端突出，则引物设计必须包含突出部分；若 5" 端突出，则引物设计可以包含突出部分，也可以不包含。

插入片段正向扩增引物：

5"—上游载体末端同源序列酶切位点（可选）基因特异性正向扩增序列— 3"

插入片段反向扩增引物：

3"—基因特异性反向扩增序列酶切位点（可选）下游载体末端同源序列—5"

注 1：尽量选择无重复序列且 GC 含量均匀的区域进行克隆，当载体克隆位点上下游25 nt 区域内 GC 含量为 40%~60% 时，重组效率最高；

注 2：本试剂盒所提供的 pUC 19 载体（Ampr）连接端序列如下：

EcoRI

5"-ATGACCATGATTACGCCA-3" 5"-AATTCACTGGCCGTCGTTTTAC-3"

3"-TACTGGTACTAATGCGGTTCGA-5" 3"-GTGACCGGCAGCAAAATG-5"

HindIII

4.插入片段的PCR扩增

推荐使用高保真 PCR Mix 进行扩增，以减少扩增突变的引入。建议使用纯化后的 PCR 产物进行无缝克隆反应，若 PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定为特异性扩增产物，可直接使用，但加样体积不应超过总反应体积的 20%。

5.重组反应

①于冰水浴中配置以下反应体系：

组分	反应体系	阴性对照	阳性对照（如有必要）
DNA Assembly Mix	5μl	5μl	5μl
线性化载体^a	50-200ng	50-200ng	pUC 19 Control Plasmid, Linearized, 1 μl
插入片段^b	10-200ng	-	500 bp Control, Fragment, 1 μl
ddH₂O	To10μl

注 3：当载体骨架在 10 kb 以上或插入片段在 4 kb 以上时，建议延长反应时间到30-60min；

注 4：50℃反应完成后，建议进行瞬时离心，将反应液收集至管底。

③ 将反应液离心管置于冰上冷却，之后进行转化或者储存于 -20℃。

注 1： -20℃储存的重组产物，建议在 1 周内使用。

6.重组产物转化

取 5~10 μl 反应液，加入到 100 μl 感受态细胞中，缓慢吸打混匀，冰上放置 30 min。42℃ 热激 45~60 sec，冰浴 5 min。加 500μl SOC 或 LB 培养基，37℃ 振荡培养 40~60 min（200 rpm）。将菌液均匀涂布在含有对应抗生素的平板上，倒置于 37℃ 过夜培养。

注 1：不同感受态细胞最后的克隆阳性率会有所差别，推荐使用转化效率 10⁸CFU/

μg 的感受态细胞；

注 2：菌落数取决于 PCR 产物与线性化载体的数量和纯度；

注 3：阳性对照平板通常生长大量白色单菌落，阴性对照平板只生长很少的菌落。

7.阳性克隆检测

挑取单菌落至 10 μl ddH2O 中混匀，95℃裂解 10 min 后，取 1 μl 裂解液作为模板，进行菌落 PCR 鉴定，或将单菌落接种至抗性培养基中培养过夜后，提取质粒进行酶切鉴定。

注 1：菌落 PCR时建议至少使用一条通用引物，避免假阳性结果；注 2：必要时可进一步对阳性结果进行测序鉴定。

问题描述	原因	解决方法
转化效率低	感受态效率低下	使用新制备或妥善保存的感受态细胞。
	DNA 片段比例不佳	按照说明书推荐的最适用量和比例配制反应体系。载体和插入片段的浓度测定：若线性化载体与插入片段已经过纯化，且经电泳检测条带单一或无 Smear 残留时，可使用超微量核酸蛋白检测仪等基于分光光度法的仪器进行浓度测定，但只有当 A260/A280 在 1.8~2.0 之间时浓度值可信；若线性化载体与插入片段未经过纯化，也可使用琼脂糖电泳测定样品浓度。
	DNA 片段纯度不够	对载体和插入片段进行胶回收纯化。由于克隆反应，因此纯化产物应溶解于 ddH2O EDTA 中，切勿使用等金属离子螯合剂会抑制无缝 Tris-EDTA 等缓冲液。
	反应产物过量	在转化体系中，无缝克隆反应产物体积不应超过感受态细胞体积的 10%。
大量克隆不含插入片段	载体线性化不完全	酶切制备线性化载体时，提高快速内切酶的使用量，延长反应时间，使用胶回收纯化酶切产物。
	相同抗性质粒污染	以质粒为模板进行插入片段 PCR 扩增时，使用预线性化质粒作为扩增模板，使用 DpnI 等甲基化敏感型内切酶对扩增产物进行处理，或对产物进行胶回收纯化。
	平板抗性不足	确保使用正确的抗生素，并使用新鲜制备的抗生素平板。
大量克隆含有不正确插入片段	非特异性 PCR 扩增产物	优化 PCR 体系，提高扩增特异性，或胶回收纯化 PCR 产物重叠序列的扩增引物。

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纯度	/	规格	20 Rxns
品牌	伊势久	产品名称	生化试剂快速DNA组装预混液 20 Rxns
名称	生化试剂快速DNA组装预混液 20 Rxns	用途范围	生化研究
包装类型	袋	储存条件	-20℃
类别	分子生物系列

组分/规格	MC001S-20Rxns	MC001M-50Rxns
DNA Assembly Mix	100μl	250μl
pUC19 Control Plasmid, Linearized (Ampr , 40 ng/μl)	5μl	5μl
500 bp Control Fragment (20 ng/μl)	5μl	5μl

伊势久生物快速DNA组装预混液 20 Rxns 50 Rxns 科研专用

实验步骤