生化试剂线粒体复合体Ⅴ检测试剂盒（微量法100T/48S）
| 价格 | ￥2600.00/盒 | |
| 起订量 | ≥1 | |
| 所在地 | 上海 上海 | 可售量 10000盒 |
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主营产品： 实验试剂,
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基本参数
| 纯度 | / | 规格 | OP017-100T/48S |
| 品牌 | 伊势久 | 产品名称 | 生化试剂线粒体复合体Ⅴ检测试剂盒（微量法100T/48S） |
| 名称 | 生化试剂线粒体复合体Ⅴ检测试剂盒（微量法100T/48S） |
线粒体复合体Ⅴ试剂盒说明书
微量法 100管/48样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
线粒体复合体Ⅴ又称F1F0-ATP合酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，由F1和F0两个亚单位组成。该酶利用呼吸链产生的质子电化学梯度催化ATP合成，也可逆过程水解ATP。此外，复合体Ⅴ还存在于叶绿体、异养菌和光合中。复合体Ⅴ是线粒体氧化磷酸化和叶绿体光合磷酸化合成ATP的关键酶。
测定原理：
复合体Ⅴ水解ATP产生ADP和Pi，通过测定Pi增加速率来测定复合体Ⅴ活性。
试剂的组成和配制：
产品名称
|
OP017-100T/48S
|
Storage
|
试剂一：液体
|
100ml
|
-20℃
|
试剂二：液体
|
80ml
|
-20℃
|
试剂三：液体
|
2ml
|
-20℃
|
试剂四：粉剂
|
1支
|
-20℃
|
试剂五：液体
|
8ml
|
4℃
|
试剂六：粉剂
|
1瓶
|
4℃
|
试剂七：粉剂
|
1瓶
|
4℃
|
试剂八：粉剂
|
1瓶
|
4℃
|
试剂九：液体
|
10ml
|
室温
|
说明书
|
一份
|
|
试剂四：粉剂×1支，-20℃保存；临用前加入2mL蒸馏水，充分溶解备用，用不完的试剂
仍-20℃保存;
试剂六：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入4mL蒸馏水，充分混匀；溶解后4℃保存一周；
试剂七：粉剂×1瓶, 4℃保存；临用前加入10mL蒸馏水，充分混匀；溶解后4℃保存一周；
试剂八：粉剂×1瓶, 4℃保存；临用前加入10mL蒸馏水，充分混匀；溶解后4℃保存一周；
定磷试剂的配制：按H2O: 试剂七:试剂八:试剂九=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷试剂应
为浅黄色。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染（请根据需要，用多少配多少）。
注意：配试剂最好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
样本的前处理：
1、准确称取0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL试剂一和10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2、将匀浆600g，4℃离心5min。
3、弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。
4、上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅴ（此步可选做）。
5、步骤4中的沉淀即为线粒体，加入800uL试剂二和8uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10秒，重复30次），用于复合体Ⅴ酶活性测定。
测定步骤：
1、酶促反应（在EP管中加入下列试剂）
试剂名称（μl）
|
对照管
|
测定管
|
试剂四
|
10
|
10
|
试剂五
|
40
|
40
|
样本
|
|
50
|
混匀， 37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）准确水浴30min
试剂六
|
20
|
20
|
样本
|
50
|
|
混匀，4000g，25℃离心10min，取上清液
混匀，570nm下比色，读取对照吸光值A1和测定管吸光值A2，计算△A=A2-A1。
2、定磷(在EP管或96孔板中加入下列试剂）
上清液
|
30
|
30
|
定磷试剂
|
170
|
170
|
混匀，室温静置10min后，在 660nm处读取A测定管和A对照管，计算ΔA=A测定管-A对照管。每个测定管设一个对照管。
5、由于每一个测定管需要设一个对照管，本试剂盒50管保证测24个NADP+或NADPH。
复合体Ⅴ活性计算：
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：
标准条件下测定的回归方程为y = 1.274x + 0.004；x为标准品浓度（mmol/L），y为A值。
1、组织中复合体Ⅴ活性的计算:
（1） 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。复合体Ⅴ活性（nmol/min/mg prot）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反总×106]÷(V样×Cpr) ÷T =62.8× (ΔA-0.004) ÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
（2） 按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性（nmol/min /g 鲜重）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反总×106]÷(W× V样÷V样总) ÷T =50.7× (ΔA-0.004) ÷W
（3） 按或细胞密度计算
单位的定义：每1万个或细胞每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性（nmol/min /104 cell）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反总×106]÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.101× (ΔA-0.004)
V反总：反应体系总体积，1.2×10-4 L； V样：加入样本体积，0.05 mL；V样总：加入提取液体积，0.808 mL；T：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或总数，500万。
b.使用96孔板测定的计算公式如下：
标准条件下测定的回归方程为y = 0.637x + 0.004；x为标准品浓度（mmol/L），y为A值。
（1） 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性（nmol/min /mg prot）=[(ΔA-0.004) ÷0.637×V反总×106]÷(V样×Cpr) ÷T
=125.6× (ΔA-0.004) ÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
（2） 按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性（nmol/min /g 鲜重）=[(ΔA-0.004)÷0.637×V反总×106]÷(W× V样÷V样总) ÷T
=101.5× (ΔA-0.004) ÷W
（3） 按或细胞密度计算
单位的定义：每1万个或细胞每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性（nmol/min /104 cell）=[(ΔA-0.004)÷0.637×V反总×106]÷(500×V样÷V样总) ÷T
=0.203× (ΔA-0.004)
V反总：反应体系总体积，1.2×10-4 L； V样：加入样本体积，0.05 mL；V样总：加入提取液体积，0.808 mL；T：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或总数，500万。
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